Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5.8 Untersuchungen im TCF21-System
der miR-224, das ICAM-1 in vitro Transkript hingegen zeigt eine schwache Komplexbildung.
Auch der zweite Kontrollversuch (Abbildungsteil B) bestätigt die Spezifität der TCF21-miR-
224-Komplexbildung. Die miR-224 weist unter allen getesteten Kombinationen aus TCF21
und miRNA die stärksten Komplexe auf. Trotz einer nur schwachen Komplexbildung der
miR-24 mit dem TCF21 in vitro Transkript, wird mittels microRNA.org-Algorithmus eine Erkennungsstelle
für die miR-24 in der TCF21 3’-UTR vorhergesagt. Diese Vorhersage konnte
durch eine TargetScan-Vorhersage nicht bestätigt werden. Trotz vergleichbarer Bindungsenergien
zur TCF21 C-miR-224-Interaktion (∆G miR−224 = -20,8 kcal/mol, ∆G miR−24 = -20,5
kcal/mol) ist die TCF21-miR-24-Komplexbildung deutlich schwächer ausgeprägt. Dies kann
mit unterschiedlichen Zugänglichkeiten im entsprechenden RNA-Bereich der miRNA-Bindestellen
erklärt werden und lässt somit den Schluss zu, dass die miR-224 Bindestelle deutlich
zugänglicher ist.
A
TCF21 3'-UTR C
[ 32 P]-miR-224 guide
-
AGTR1 3'-UTR A
ICAM-1 3'-UTR
[ 32 P]-miR-224
TCF21 3'-UTR C
[ 32 P]-miR-24
[ 32 P]-miR-195
0 30 120 0 30 120 0 30 120 0 30 120 t in s 0 30 120 0 30 120 0 30 120 120 120 120
B
-
[ 32 P]-miR-224
[ 32 P]-miR-24
[ 32 P]-miR-195
Komplex
miRNA
Abbildung 5.52: Kinetik der spezifische Komplexbildung zwischen TCF21 und miR-224. (A) Zur
Überprüfung der Komplexbildung von miR-224 mit weiteren in vitro Transkripten erfolgte eine Inkubation
des miR-224 guide Stranges (0,5 nM) parallel mit in vitro Transkripten von TCF21, AGTR1 oder
ICAM-1 (je 5 nM) bzw. H 2 O als Kontrolle in Anwesenheit von 10 mM CTAB für 0-120 s bei 37 °C. (B)
Zur Kontrolle der Komplexbildung der TCF21 3’-UTR mit weiteren miRNAs wurde das TCF21 3’-UTR
C in vitro Transkript (5 nM) parallel mit miR-224, miR-24 und miR-195 guide Strang (0,5 nM) in Anwesenheit
von 10 mM CTAB für 0-120 s bei 37 °C inkubiert. Alle Reaktionen wurden durch Zugabe
von Stopp-Puffer und Einfrieren in flüssigem Stickstoff beendet und die Proben bei 4 °C und 150 V
auf einem 8 %-igen, nativen PAA-Gel aufgetrennt.
Annealing von miRNAs an verkürzte TCF21 in vitro Transkripte
Analog zu den Versuchen mit den Gesamtlänge TCF21 3’-UTR in vitro Transkripten wurden
Annealing-Experimente mit verkürzten TCF21 in vitro Transkripten durchgeführt. Die Analy-
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