Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5.8 Untersuchungen im TCF21-System
wendung der miR-224_SNP hingegen ist keinerlei Komplexbildung detektierbar. Im Gegensatz
dazu bildet das TCF21 G in vitro Transkript mit beiden miRNA-Varianten annähernd
gleich starke Komplexe. Der mismatch zwischen Ziel-RNA und miRNA im seed Bereich hat
also für die TCF21 C-Variante im Umkehrschluss einen deutlich messbaren Einfluss auf die
Bindung der miR-244_SNP nicht aber für die TCF21 G-miR-224-Interaktion. Die seed-match
Interaktion des TCF21 C in vitro Transkripts mit der miR-224 bildet deutlich stärkere Komplexe
im Vergleich zur TCF21 G-miR-224_SNP-Interaktion. Es ist vorstellbar, dass durch die
offene Struktur der TCF21 C SNP-Region (siehe Abb. 5.35) der mismatch zur miR-224_SNP
einen größeren Einfluss auf die RNA-RNA-Wechselwirkung hat. In Folge des C-C mismatch
scheint es sterisch schwieriger, die Paarung mit den miRNA-Basen 2 und 3 ausgehend vom
5’-Ende einzugehen. Dadurch wird die Wechselwirkung beider RNAs am 5’-Ende der miRNA
deutlich destabilisiert, was dazu führen kann, dass keine Komplexe detektierbar sind.
Der anschließend durchgeführten Versuch des Annealings von TCF21 und miR-224 in
Abwesenheit von CTAB (siehe Abb. 5.51) ergab ähnliche Verläufe der Komplexbildung. Für
die Reaktionen mit der miR-224 ist erneut eine favorisierte Komplexbildung mit der TCF21
C-Variante sichtbar. Im Vergleich zur TCF21 G-Variante ist zu jedem Zeitpunkt der Probenentnahme
eine deutlich stärkere Komplexbildung zwischen dem C in vitro Transkript und der
miR-224 detektierbar.
Die aus den Annealing-Daten berechneten Geschwindigkeitskonstanten der Reaktionen
von TCF21 3’-UTR in vitro Transkript mit der entsprechenden miRNA sind in der Tab. 5.17
zusammengefasst. Die größte Ratenkonstante, sowohl mit als auch ohne CTAB, ist jeweils
für die TCF21 C in vitro Transkript-miR-224-Interaktion zu verzeichnen. Die Ratenkonstante
der TCF21 G-miR-224_SNP-Interaktion konnte nicht bestimmt werden, da ein linearer
Verlauf der Komplexbildung nicht detektierbar war. Die Bildung der Komplexe des TCF21
G in vitro Transkripts mit beiden miR-224-Varianten ergab in Anwesenheit von CTAB nahezu
identische Ratenkonstanten. Der Vergleich des Anealings in An- bzw. Abwesenheit von
CTAB zeigt, dass das Annealing der miR-224 an beide TCF21-Varianten etwa um den Faktor
60 beschleunigt wird. Das miR-224_SNP Annealing an das TCF21 G in vitro Transkript wird
durch CTAB um das ca. 170-fache beschleunigt.
Tabelle 5.17: Ratenkonstanten des miRNA-Annealings der TCF21 3’-UTR-Varianten in An- und Abwesenheit
von CTAB (siehe Abb. 5.50 und 5.51). (n.d. nicht detektierbar)
CTAB + -
in vitro Transkript miRNA k (M -1 s -1 ) k (M -1 s -1 ) Faktor
TCF21 3’-UTR C miR-224 2,2·10 6 ± 1,9·10 5 3,3·10 4 67
miR-224_SNP n.d. n.d. n.d.
TCF21 3’-UTR G miR-224 1,4·10 6 ± 2,6·10 5 2,3·10 4 61
miR-224_SNP 1,4·10 6 ± 3,2·10 5 8,4·10 3 167
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