Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5 Ergebnisse
Die kurzen bzw. langen AGTR1-Reporter wurden mit steigenden Mengen an siRNA (0,1,
1 und 10 nM) ko-transfiziert. Es konnte für alle Kombinationen eine konzentrationsabhängige
Repression der Reporter-Aktivität beobachtet werden (Daten nicht gezeigt). Die Abb. 5.8
zeigt die Ergebnisse der Ko-Transfektion jedes AGTR1 Reporters mit 10 nM der entsprechenden
siRNAs.
120
98
100
88
FL/RL in %
80
60
71
55
52
64
78
AGTR1 A
AGTR1 C
40
34
20
0
kurz 3′-UTR kurz 3′-UTR
siAGTR1 A
siAGTR1 C
Abbildung 5.8: Unterschiedliche siRNA-vermittelte Hemmung der kurzen und langen AGTR1-
Reporter. HeLa-Zellen wurden im 24-well Format mit je 100 ng AGTR1 Reporterplasmid (pMIR-
Luci AGTR1 kurz A bzw. C oder pMIR-Luci AGTR1 3’-UTR A bzw. C), 1 ng pRL-CMV-Plasmid und
10 nM siAGTR1 A bzw. C ko-transfiziert. Nach 24 h wurden die Zellen lysiert und anschließend die
Luciferase-Aktivität gemessen. Die relativen firefly Luciferase-Aktivitäten (FL/RL) wurden auf Ansätze
ohne siRNA (nur Plasmid-DNA) normiert. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen
von mindestens zwei unabhängigen Experimenten.
Es sind deutliche Unterschiede zwischen der siRNA-vermittelten Hemmung der kurzen
(nur miR-155 Bindestelle) und langen (gesamte 3’-UTR) Reporter zu verzeichnen. Im Ergebnis
einer vergleichenden Analyse werden die langen AGTR1-Reporter grundsätzlich besser
durch die jeweils verwendeten siRNAs gehemmt (kurz A vs. 3’-UTR A bzw. kurz C vs. 3’-UTR
C).
Die Versuche mit den kurzen Reportern zeigen, dass die passende siRNA, also siAGTR1
A zu AGTR1 A und siAGTR1 C zu AGTR1 C, eine ausgeprägtere Repression aufweisen als
im Falle des Vorhandenseins eines mismatches zwischen Ziel-RNA und siRNA (siAGTR1
C-AGTR1 A und siAGTR1 A-AGTR1 C). AGTR1 A toleriert den mismatch zur siAGTR1 C
besser als AGTR1 C einen solchen zur siAGTR1 A (88 vs. 98 % Reporteraktivität), jedoch
ist die Hemmung des AGTR1 C durch die vollständig komplementäre siRNA effektiver (64
vs. 71 % Luciferase-Aktivität). Die Repression der beiden langen Reporter durch siAGTR1 A
ist in etwa vergleichbar (55 und 52 % Restaktivität), wohingegen die siAGTR1 C den langen
AGTR1 C Reporter selektiv stärker hemmt (78 vs. 34 %). Weiterhin kann bilanziert werden,
dass die AGTR1 3’-UTR C-Variante von beiden siRNAs effizienter gehemmt wird, denn
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