Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5.8 Untersuchungen im TCF21-System
224_SNP aufgrund der seed Komplementarität vorwiegend das TCF21 G Transkript, so ist
ein verändertes stöchiometrisches mRNA-miRNA-Verhältnis, das zur beobachteten Reduktion
der TCF21 G Transkripte führt, vorstellbar. Mittels weiterer Experimente, bei denen z.B.
variierende Mengen an Plasmid-DNA bzw. miRNA transfiziert werden, könnten mögliche
Dosis-Effekte näher untersucht werden.
Weiterhin offen ist, warum es nach miRNA-Transfektion in einigen Ansätzen zu einem
relativem Anstieg der TCF21-Transkriptmenge kommt. So ist es denkbar, dass durch Variationen
der Plasmid-DNA bzw. miRNA unterschiedliche intrinsische Faktoren beeinflusst
werden können.
Die Ergebnisse der miRNA-vermittelten Hemmung der TCF21-Varianten auf Proteinebene
sind in Abb. 5.43 dargestellt. Unabhängig davon, ob das TCF21 C-Plasmid einzeln oder
als Gemischbestandteil transfiziert wurde, fällt die miR-224-vermittelte Hemmung der Luciferase-Aktivität
stärker aus (18 bzw. 16 %). Die miR-224_SNP hingegen führt zu einer Repression
der TCF21 C-Reporteraktivität um 3 %. Die TCF21 G-Variante zeigt keine signifikanten
Unterschiede zwischen der miR-224- und miR-224_SNP-vermittelten Hemmung der Reporteraktivität
(jeweils 92 % relative Luciferase-Aktivität).
120
FL/RL in %
100
80
60
40
82
97
92 92
84
91
miR-224
miR-224_SNP
20
0
C G C+G
Plasmid alleine
Plasmid-Gemisch
Abbildung 5.43: miRNA-vermittelte Hemmung von TCF21 auf Proteinebene. Die TCF21 3’-UTR
C- bzw. G-Reporterplasmide wurden einzeln oder als Gemisch (12-well-Format, 100 ng Plasmid-
DNA) in HeLa-Zellen mit 50 nM miR-224 bzw. miR-224_SNP ko-transfiziert. Nach einer 24-stündigen
Inkubation wurden die Zellen geerntet und die Luciferase-Reporteraktivitäten gemessen. Die relativen
firefly Luciferase-Aktivitäten (FL/RL) wurden auf Ansätze ohne miRNA (nur Plasmid-DNA) normiert.
Gezeigt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus zwei unabhängigen Experimenten.
Die vorstehenden Analysen zeigen, dass die beiden TCF21-Varianten Unterschiede in
der miRNA-vermittelten Regulation aufweisen. Während die TCF21 C-Variante differentiell
durch die beiden miR-224-Varianten reguliert wird, ist dies für die TCF21 G-Variante nicht
zu beobachten. Im Vergleich zur miR-224_SNP wird eine deutlich stärkere Hemmung der
TCF21 C-Variante, sowohl auf mRNA- als auch Protein-Ebene, durch die miR-224 vermittelt.
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