Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5 Ergebnisse
A
[ 32 P]-miR-224 guide
[ 32 P]-miR-224_SNP guide
TCF21 3'-UTR C
TCF21 3'-UTR G
-
- TCF21 3'-UTR C TCF21 3'-UTR G
0 6,66 20 40 120
0 6,66 20 40 120
0 80 t in min
Komplex
0 80 0 6,66 20 40 120 0 6,66 20 40 120
miRNA
B
30
% Komplex
25
20
15
10
5
0
2,7 1,1
24,2
19,8
20,9
16,1
0,40,6 0,6 1,2 0,4 1,3 0,5 1,6 0,5 2,4
11,4
8,4
4,9
6,5
0 6,6 min 20 min 40 min 80 min 0 6,6 min 20 min 40 min 80 min
TCF21 3′-UTR C
TCF21 3′-UTR G
miR-224
miR-224_SNP
Abbildung 5.51: Unterschiedliche Kinetik der Komplexbildung der TCF21 3’UTR Varianten mit miR-
224 und miR-224_SNP in Abwesenheit von CTAB. TCF21 3’-UTR C bzw. G in vitro Transkripte (25
nM) wurden mit miR-224 bzw. miR-224_SNP guide Strang (0,5 nM) in Abwesenheit von CTAB für 0-
80 min bei 37 °C inkubiert. Als Negativkontrolle diente jeweils ein Ansatz ohne in vitro Transkript. Die
Reaktionen wurden durch Zugabe von Stopp-Puffer und Einfrieren in flüssigem Stickstoff beendet und
die Proben bei 4 °C und 150 V auf einem 8 %-igen, nativen PAA-Gel elektrophoretisch aufgetrennt.
(A) Gele, (B) Quantifizierung der Komplexe.
Die Ergebnisse des RNA-RNA-Annealings weisen darauf hin, dass nicht nur thermodynamische
(seed-match vs. seed-mismatch) sondern auch strukturelle Unterschiede eine Rolle
für die differentielle miRNA-Regulation der TCF21-Varianten spielen.
Zur Überprüfung der Spezifität der zwischen der TCF21-RNA und der miR-224 beobachteten
Komplexbildung wurden die miR-224 mit weiteren in vitro Transkripten bzw. andere
miRNAs mit dem TCF21 C in vitro Transkript inkubiert. Die Resultate dieser Kontrollversuche
sind in der Abb. 5.52 dargestellt. Im Abbildung-Teil A ist zu erkennen, dass das TCF21
in vitro Transkript den stärksten Komplex mit der miR-224 bildet. Im Vergleich zur Negativkontrolle
(kein in vitro Transkript) bildet das AGTR1 in vitro Transkript keine Komplexe mit
124