Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5 Ergebnisse
5.1 Erste methodische Analysen
Ein methodisches Ziel des Dissertationsprojektes war vorerst die Etablierung eines zellulären
Reportersystems zur Analyse des Einflusses von SNPs in miRNA Bindestellen auf die
miRNA-vermittelte Regulation. Dazu wurden DNA-Oligonukleotide, die der miRNA Bindestelle
des jeweiligen Ziel-mRNA Abschnittes entsprechen, synthetisch hergestellt und anschließend
in einen Luciferase Reporter-Vektor kloniert. Durch anschließende Ko-Transfektion
mit synthetisch hergestellten miRNAs und nachfolgender Messung der Reportergen-
Aktivität sollte der Einfluss des SNPs auf die Interaktion zwischen Ziel-RNA und miRNA
analysiert werden. Diese Vorgehensweise versprach ein einfaches und schnelles Screening
einer Vielzahl verschiedener Kombinationen aus Ziel-mRNAs und miRNAs.
Zum Testen des Reportersystems wurde anfangs nach bereits publizierten Daten zu einer
entsprechenden Ziel-RNA-miRNA-Interaktion gesucht, für die das Vorhandensein eines
SNPs innerhalb der Ziel-mRNA mit einer Dysregulation der miRNA-Regulation einhergeht.
Nach umfassender Literatur-Recherche wurde sich für die AGTR1-miR-155-Interaktion entschieden,
die durch den SNP rs5186 (A/C-Polymorphismus) beeinflusst wird. Die Ergebnisse
zweier unabhängiger Arbeitsgruppen [145–147] hatten gezeigt, dass das Vorliegen der
AGTR1 C-Variante zu einer verminderten Hemmung durch die miR-155 und damit zu einem
Anstieg der AGTR1 Protein-Menge führt. In diesen Studien wurden bereits Reportergen-
Experimente durchgeführt, jedoch enthielten die verwendeten Reporter-Plasmide jeweils die
gesamte 3’-UTR Sequenz. Im Ergebnis vorgenannter Ausführungen erschien der AGTR1
rs5186 SNP als geeigneter Modell-SNP, um mit der Etablierung eines Zellkultur-Reportersystems
zu beginnen.
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