Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5.8 Untersuchungen im TCF21-System
der jeweiligen Gleichung der Regressionsgeraden wurde die Menge an TCF21 C- bzw. G-
Transkripten in den Proben berechnet. Eine Beeinflussung der Ergebnisse durch endogene
TCF21-Transkripte konnte durch Messung der untransfizierten HeLa-Zellen ausgeschlossen
werden (Daten nicht gezeigt). Zusätzlich wurde von jeder Probe die Expression des house
keeping Gens Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) gemessen.
A
ct-Werte
10 2
40
C Primer
10 3 10 4 10 5 10 6 10 7
C Template
35
G Template
30
25 y = -1,9528Ln(x) + 48,985
20
15
Kopien Template
B
ct-Werte
10 2
40
G Primer
10 3 10 4 10 5 10 6 10 7
C Template
35
G Template
30
25
y = -1,5893Ln(x) + 42,652
20
15
Kopien Template
Abbildung 5.41: qPCR-Standardkurven zur Berechnung der TCF21-Transkriptmenge. Es wurden
jeweils 10 3 -10 6 Kopien Template in die qPCR eingesetzt und die ct-Werte bestimmt. (A) zeigt die
Standardkurven für die Amplifikation beider TCF21-Templates mit dem TCF21 C MM20G-Primer als
RV-Primer. In (B) sind die Standardkurven für die Amplifikation beider TCF21-Templates mit dem
TCF21 G MM20G-Primer als RV-Primer dargestellt.
Verschiedene Faktoren können zu den im Folgenden diskutierten relative Änderung der
TCF21 Transkriptmengen beigetragen haben. Die siRNA-vermittelte Regulation der Genexpression
wird hauptsächlich über die Spaltung der Ziel-mRNA vermittelt. Im Gegensatz dazu
induzieren miRNAs in der Regel eine translationale Hemmung, eine mRNA-Destabilisierung
oder einen mRNA-Abbau und nur in seltenen Fällen eine mRNA-Spaltung (siehe Abb. 2.3).
Eine Veränderung der gemessenen TCF21 Transkriptmengen kann also auf eine miRNAvermittelte
Beeinflussung der TCF21 mRNA zurückzuführen sein. Auch Unterschiede in der
Lokalisation der mRNA und damit deren Isolierbarkeit bzw. Nachweismöglichkeit ist denkbar.
Im Rahmen von Kontrollexperimenten wurde eine Kontamination der RNA-Extrakte mit
Plasmid-DNA detektiert. Die Menge an gemessener Plasmid-DNA war in den unterschiedlichen
Ansätzen (Transfektion der Plasmid-DNA ohne miRNA, Ko-Transfektion mit miR-224
bzw. miR-224_SNP) gleichmäßig (Daten nicht gezeigt). Die Absolutwerte der in Abb. 5.42
dargestellten Ergebnisse werden dadurch beeinflusst. Es ist jedoch anzunehmen, dass die
relativen Unterschiede bestehen bleiben. Für eine Festigung der beobachteten Ergebnisse
sind dennoch weitere Versuche nötig. So muss eine Beseitigung der Plasmid-DNA Kontami-
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