Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

4 Methoden
Als Beschleuniger des RNA-RNA-Annealings wurde das quaternäre Ammoniumsalz Cetyltrimethylammoniumbromid
(CTAB) eingesetzt. CTAB beschleunigt die Kinetik von RNA-
RNA-Interaktionen unter Bedingungen, die weder die RNA-Struktur noch die sich ergebende
Struktur-Funktions-Beziehung beeinflussen [127–130].
5′
t
3′
RNA-RNA Komplex
3′
5′
3′
5′
ss miRNA bzw. siRNA
Abbildung 4.3: Schematische Darstellung des RNA-RNA-Annealings. Renaturierte in vitro Transkripte
wurden mit radioaktiv markierten miRNA bzw. siRNA guide Strängen inkubiert, um die Bindung der
kurzen RNA an die in vitro Transkripte zu analysieren. Die Komplexbildung konnte elektrophoretisch
detektiert werden, da der RNA-RNA-Komplex größer als der markierte Einzelstrang ist und damit
nicht so weit in das Gel einläuft. Bindet die kurze RNA an das in vitro Transkript, so kommt es zeitabhängig
zur Abnahme des Signals der einzelsträngigen kurzen RNA und gleichzeitig zum Anstieg des
Signals des Komplexes aus si/miRNA und in vitro Transkript.
Zunächst wurden, wie in Abschnitt 4.2.14 beschrieben, in vitro Transkripte hergestellt, danach
in H 2 O vorverdünnt und 1:1 mit 2×Annealing-Faltungspuffer auf die gewünschte Konzentration
verdünnt. Über einen Zeitraum von 10 min bei 65 °C erfolgte die Denaturierung
der in vitro Transkripte und anschließend deren Renaturierung durch langsames Abkühlen.
Die am 5’-Ende 32 P-markierten miRNA bzw. siRNA guide Stränge (siehe 4.2.12) wurden
mit H 2 O auf 10 nM verdünnt. Die in vitro Transkripte (5-50 nM Endkonzentration) wurden
in 200 µl PCR-Tubes mit Hybridisierungspuffer und ggf. mit 10 mM CTAB auf Eis vorgelegt.
Die Reaktion wurde durch Zugabe des markierten Einzelstranges (0,5 nM Endkonzentration)
gestartet und, soweit nicht anders angegeben, bei 37 °C im PCR-Block inkubiert. Zu
verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen, diese 1:1 mit Stopp-Puffer versetzt
und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Proben wurden kurz auf Eis angetaut und
dann auf einem nativen, 8 %-igen PAA-Gel elektrophoretisch aufgetrennt, die Gele anschließend
in Folie eingeschweißt und nach Auflegen eines Phosphor-Storage-Screens bis zur
Detektion der Signale bei -20 °C gelagert.
Die Auswertung der Komplexbildung erfolgte unter Verwendung der ImageQuant-Software.
Dabei wurde der prozentuale Anteil des Komplexes bezogen auf die Gesamtmenge
an Signal in der gesamten Bahn bestimmt.
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