Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

4 Methoden
Präparation von Vektor und Insert
Die Leervektoren wurden mit den entsprechenden Restriktionsenzymen linearisiert und ggf.
dephosphoryliert (siehe 4.2.5 und 4.2.11). Die synthetischen kurzen Inserts wurden, wie
in Abschnitt 4.2.13 beschrieben, hergestellt und direkt in die Ligationsreaktion eingesetzt.
Die durch PCR gewonnenen Inserts (siehe 4.1.1) wurden entsprechend ihrer Restriktions-
Schnittstellen mit den jeweiligen Enzymen restringiert (siehe 4.2.5) und anschließend mittels
Gelelektrophorese aufgereinigt (siehe 4.2.8).
Ligation
Zur Ligation des gewünschten Ziel-Gen mRNA-Abschnitts wurden 20-100 ng Vektor (pMIR-
REPORT bzw. pmirGLO, siehe 3.5.5) mit dem 5-fachen molaren Überschuss an Insert unter
Verwendung von 1 u T4 DNA Polymerase in die Ligationsreaktion (f.v. 15 µl) eingesetzt.
Die Ligation erfolgte für eine Stunde bei Raumtemperatur gefolgt von einer abschließenden
Inkubation bei 70 °C für 5 min zur Deaktivierung der Ligase.
Transformation in E.coli
Eine Transformation von elektrokompetenten E.coli Bakterien mit 1 µl des in Abschnitt 4.1.4
beschriebenen Ligationsansatzes erfolgte mittels Elektroporation (200 Ω, 25 µF, 2,5 kV,
τ = 4-6 ms). Die elektroporierten Bakterien wurden für 1 h bei 37 °C schüttelnd in LB Medium
inkubiert und anschließend auf LB-Platten, die 100 µg/ml Ampicillin enthielten, ausplattiert
(50-400 µl) und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
Klonierungskontrollen
Die synthetischen Inserts der kurzen AGTR1 und ESR1 Reportergen-Konstrukte (= nur
miRNA Bindestelle) enthielten zusätzlich eine BlpI Schnittstelle, sodass nach Plasmid-DNA
Extraktion durch Restriktion mit BlpI das Vorhandensein des Inserts bestätigt werden konnte.
Bei der Klonierung der langen 3’-UTR-Reportergen-Konstrukte wurden zunächst Kolonie-
PCRs durchgeführt (siehe 4.1.1) und von den Klonen, bei denen ein PCR-Fragment amplifiziert
wurde, Plasmid-DNA isoliert (siehe 4.2.4) und diese durch Restriktion (siehe 4.2.5)
analysiert. Zur Überprüfung aller Inserts erfolgte eine Sequenzierung der Plasmid-DNA (siehe
4.1.2).
4.1.5 Herstellung elektrokompetenter E.coli
Vor dem Einbringen von Nukleinsäuren in E. coli wurden die Bakterien durch mehrfaches
Waschen von Salzen befreit und somit in einen als elektrokompetent bezeichneten Zustand
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