Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5 Ergebnisse
A
firefly Luciferase „ESR1 kurz“
ESR1 3′-UTR
Pos. 71-101
2330 2360
5′ 3′
BlpI
AUG
stop rs9341070
1 653 2309 2355 2373
SV40 Poly A
MCS
B
5′-UTR
CDS
firefly Luciferase „ESR1 3′-UTR“
3′-UTR
ESR1 3′-UTR
Pos. 1-1268
2330
3597
5'
3′
AUG
stop rs9341070
1 653 2309
2425
3635
5′-UTR CDS 3′-UTR
Abbildung 5.16: ESR1 Luciferase-Reportertranskripte. Schematischer Aufbau der Luciferase-Transkripte:
in (A) die, die nur die Sequenz der miR-122 Bindestelle aus der ESR1 3’-UTR enthalten und
in (B) die, die einen ca. 1300 nt langen Ausschnitt der ESR1 3’-UTR enthalten.
5.4.4 Untersuchungen zur Rolle des SNPs auf die miRNA-vermittelte
Regulation von ESR1
Zur Untersuchung des Einflusses des SNPs innerhalb der miR-122 Bindestelle in der ESR1
3’-UTR auf die miRNA-vermittelte Regulation wurden die vier verschiedenen ESR1 Reporter-
Plasmide (kurz C bzw. T, 3’-UTR C bzw. T) mit drei verschiedenen miRNA-Tools ko-transfiziert:
pre-miR-122, miR-122 und miR-122_SNP. Die Komplementarität der guide Stränge
beider letztgenannten mit der jeweiligen ESR1-Variante sind in der Abb. 5.15 dargestellt.
Die miR-122 ist durch eine an der Position 2 vom 5’-Ende der miRNA und somit im gesamten
seed Bereich (Position 2-8) bestehenden Komplementarität zur ESR1 C-Variante gekennzeichnet.
Die ESR1 U-Variante dagegen weist ein U-G Wobble Basenpaar auf. Durch
Einführung eines G>A Basenaustausches an Position 2 des miR-122 guide Stranges wird
die miR-122_SNP generiert. Diese führt für das ESR1 U-Transkript zu einer vollständigen
Komplementarität im gesamten seed Bereich jedoch zu einem C-A mismatch mit der ESR1
C-Variante. Die pre-miR-122 ist ein chemisch modifizierter, partieller Doppelstrang, dessen
Sequenz und Modifikationen vom Hersteller Ambion nicht angegeben sind.
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