Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5.3 Untersuchungen im AGTR1-System
Diese Analysen verdeutlichen den Einfluss eines mismatches zwischen Ziel-mRNA und
miRNA auf die thermodynamische Stabilität der RNA-RNA-Wechselwirkung.
5.3.3 Verwendete AGTR1 Reportergen-Konstrukte
Zur Analyse des Einflusses des SNPs rs5186 auf die miR-155-vermittelte Hemmung von
AGTR1 wurden zunächst Minimal-Reporterkonstrukte hergestellt (siehe Abb. 5.3). Diese
Vorgehensweise wurde bereits mehrfach in der Literatur beschrieben und zeichnet sich
durch ihre einfache Handhabung aus. Es werden dafür kurze DNA-Oligonukleotide synthetisiert,
die neben der Sequenz der jeweiligen miRNA Bindestelle noch Restriktions-Schnittstellen
zur gerichteten Klonierung an ihren Enden enthalten (der Generierung der notwendigen
Oligonukleotide und Primer wurde die NCBI Referenz-Sequenz NM_031850.2 3 zugrunde
gelegt). Zur einfachen Überprüfung positiver Klone wurde zudem eine BlpI Schnittstelle eingefügt.
Nach einer Hybridisierung von sense und antisense Oligonukleotid erfolgt die Ligation
in den gewünschten Reportergen-Vektor.
5′-UTR CDS 3′-UTR
AGTR1 3′-UTR
Pos. 64-94
2330
2360
5′ 3′
AUG
stop
rs5186
BlpI
1 653 2309
2352 2373
SV40 Poly A
MCS
5′-UTR
CDS
3′-UTR
Abbildung 5.3: AGTR1 Luciferase-Reporter-Transkript der AGTR1 miR-155 Bindestelle. Die Sequenzen
der AGTR1 A bzw. AGTR1 C miR-155 Bindestelle wurden in die MCS des pMIR-REPORT
Vektors kloniert. Im Ergebnis dessen entstand die AGTR1 A- bzw. C-Variante des schematisch dargestellten
Luciferase-Reporter-Transkripts.
Die im folgenden Abschnitt erläuterten Ergebnisse führten dazu, dass im Rahmen dieser
Arbeit ebenfalls Reporter-Plasmide mit der gesamten AGTR1 3’-UTR-Sequenz generiert
wurden. Die so entstandenen Reporter-Transkripte sind in der Abb. 5.4 dargestellt.
3 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_031850.2
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