Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5 Ergebnisse
[ 32 P]-siAGTR1 A guide
[ 32 P]-siAGTR1 C guide
Komplex
unverdaut
-
-
AGTR1 A
10
100
- -
-
0.05
-
1
-
-
AGTR1 C
10
100
- -
-
0.05
-
1
-
- -
- -
passenger
RNase T1 [u]
RNase A [µg/ml]
-
-
-
passenger
-
-
-
-
AGTR1 A
10
100
- -
-
0.05
-
1
-
-
AGTR1 C
10
100
- -
-
0.05
-
1
Komplex
unverdaut
Komplex
T1 verdaut
Komplex
A verdaut
ds siAGTR1
siAGTR1
guide
Komplex
T1 verdaut
Komplex
A verdaut
Abbildung 5.13: Komplexe aus AGTR1 3’-UTR und siAGTR1 sind vor RNase-Abbau geschützt.
AGTR1 3’-UTR A bzw. C in vitro Transkript (50 nM) wurden mit siAGTR1 A bzw. C guide Strang
(0,5 nM) in 1×Hybridisierungspuffer und ohne CTAB für 40 min bei 37 °C inkubiert und anschließend
mit H 2 O, RNase T1 (10 und 100 units) oder RNase A (0,05 und 1 µg/ml) für 4 min bei Raumtemperatur
hydrolysiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von Stopp-Puffer und Einfrieren in flüssigem
Stickstoff beendet und die Proben bei 4 °C und 150 V auf einem 8 %-igen nativen PAA-Gel aufgetrennt.
Die vor RNase-Abbau geschützten Komplexe sind durch rote Pfeile markiert.
5.3.10 Zusammenfassung und Fazit der AGTR1-Analysen
Als Ausgangspunkt der Etablierung eines Reportergen-Assays zur Untersuchung des Einflusses
von SNPs in Ziel-mRNAs auf die miRNA-vermittelte Regulation der Genexpression
dienten bereits publizierte Daten zur differenzierten miR-155-vermittelten Regulation der
AGTR1 rs5186 Varianten. Mit dem Ziel der schnellen Analyse diverser Ziel-mRNA-miRNA-
Interaktionen wurde die Sequenz der miRNA Bindestelle der Ziel-mRNA in Form kurzer, synthetischer
DNA-Oligonukleotide in den Reporter-Vektor kloniert. Jedoch zeigte sich bereits
im Ergebnis erster Analysen, dass sich die pre-miR-155-vermittelte Regulation der beiden
kurzen AGTR1-Reporter von der der langen AGTR1-Reporter unterscheidet. Auch in weiteren
Analysen mit miR-155 und miR-155_SNP konnten Unterschiede in der Regulation der
kurzen und langen Reporter beobachtet werden. Diese Ergebnisse ließen einerseits vermuten,
dass das Maß der miR-155-vermittelten Hemmung durch den Sequenzkontext um die
miR-155 Bindestelle beeinflusst wird. Zum anderen weisen die Daten auf eine differenzierte
Regulation der AGTR1-Varianten infolge von Unterschieden in der Sekundärstruktur hin.
Zudem zeigen auch die ergänzend durchgeführten Untersuchungen zur Bestimmung möglicher
Auswirkungen des SNPs auf die siRNA-vermittelte Regulation von AGTR1 einen Ein-
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