Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5.4 Untersuchungen im ESR1-System
kcal/mol). Die ESR1 U-Variante weist mit beiden miRNA guide-Strängen vergleichbare Energien
auf (∆G = -18,7 bzw. -18,8 kcal/mol). Dies ist damit zu erklären, dass sie einen G-U
Wobble mismatch zur miR-122 bildet. Der mismatch zwischen ESR1 C und miR-122_SNP
hat den größten Einfluss auf die Bindungsenergie (∆∆G = +4 kcal/mol).
ESR1 C
ESR1 U
3′ G U
U
U
G
5′ N N N C C
U
G
U
G
G C U
ΔG = -20.7 kcal/mol A
rs9341070 A
U
A
C
A
C
A
C
U
C
G C
G G A G U G U G A
3′ N N N
ESR1
mRNA U
5′
miR-122
guide
3′ G U
U
U
G
5′ N N N C C
U
G
U
G
G
ΔG = -16,7 kcal/mol C
rs9341070 U
A A
U
A
C
A
C
A
C
C
U
C
G A G U G U G A
3′ N N N
ESR1
mRNA
5′ U A
miR-122_SNP
guide
3′ G U
U
U
G
5′ N N N C C
U
G
U
G
G C U
A
ΔG = -18,7 kcal/mol rs9341070 A
U
A
C
A
C
A
C
U
C
G U
G G A G U G U G A
3′ N N N
ESR1
mRNA
U
5′
miR-122
guide
3′ G U
U
U
G
5′ N N N C C
U
G
U
G
G
ΔG = -18,8 kcal/mol
C U
A
rs9341070 A
U
A
C
A
C
A
C
U
C G U G U G A
U
3′ N N N GU A G
ESR1
mRNA 5′
miR-122_SNP
guide
A
Abbildung 5.15: Lokale Bindungsenergien zwischen ESR1 rs9341070- und miR-122-Varianten.
Spaltenweise Darstellung der Ergebnisse für die ESR1-Varianten (C links, U rechts) und zeilenweise
die Unterteilung nach den miR-122-Varianten (oben: miR-122, unten: miR-122_SNP).
5.4.3 Verwendete ESR1 Reportergen-Konstrukte
Zur Klonierung der ESR1 Reportergen-Konstrukte wurden die notwendigen Oligonukleotide
und Primer gemäß der NCBI Referenz-Sequenz NM_001122742.1 6 generiert. Die Analysen
im ESR1-System wurden zunächst zeitgleich mit den AGTR1-Analysen durchgeführt.
Daher erfolgte in Analogie zur Analyse der AGTR1-miR-155-Interaktion auch für das ESR1-
miR-122-System zuerst die Klonierung von Reporter-Konstrukten mit ausschließlich enthaltener
miR-122 Bindestelle sowie je vier flankierende Nukleotiden. Aufgrund ihrer Länge von
4300 nt wurde zusätzlich nur ein Ausschnitt der ESR1 3’-UTR (Position 1-1268) kloniert. Die
entsprechenden klonierten ESR1 mRNA-Sequenzabschnitte innerhalb der rekombinanten
firefly Luciferase-Transkripte sind in der Abb. 5.16 schematisch gezeigt.
6 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001122742.1
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