Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

4 Methoden
EtOH. Die gefällte DNA wurde luftgetrocknet, in Nuklease-freiem H 2 O resuspendiert und
deren Konzentration bestimmt (siehe 4.2.1).
4.2.8 Gelextraktion
Die zu extrahierende Nukleinsäure (restringierte Plasmid-DNA oder PCR-Produkte) wurde
auf einem Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt (siehe 4.2.2), das gewünschte Fragment
mit einem Skalpell ausgeschnitten und die Nukleinsäure mit dem Wizard ® SV Gel and
PCR Clean-Up Kit nach Herstellerangaben isoliert.
4.2.9 Aufreinigung von PCR-Produkten
Zur Aufreinigung von PCR-Produkten wurde das Wizard ® SV Gel and PCR Clean-Up Kit gemäß
den Herstellerangaben verwendet. Die PCR-Produkte wurden direkt aufgereinigt oder
zunächst mittels Agarose-Gelelektrophorese (siehe 4.2.2) aufgetrennt, das gewünschte Gelfragment
mit einem Skalpell ausgeschnitten und dann nach Herstellerangaben aufgereinigt.
4.2.10 Einengen von Nukleinsäuren
Das Konzentrieren von Nukleinsäure-Lösungen erfolgte durch Vakuumzentrifugation mittels
Speed Vac ® .
4.2.11 Dephosphorylierung von Plasmid-DNA
Die linearisierte Plasmid-DNA wurde dephosphoryliert, um eine Selbstligation des Vektors
während der Klonierung zu unterbinden. Dazu wurde ca. 1 µg des Vektors in einer 20-µl-
Reaktion in 1×Reaktionspuffer mit 1 u Alkalischer Phosphatase für 60 min bei 37 °C inkubiert
und anschließend mittels Gelelektrophorese aufgereinigt (siehe 4.2.8).
4.2.12 Radioaktive Endmarkierung
Zur radioaktiven Markierung des 5‘-Endes eines Oligonukleotides wurde folgender Reaktionsansatz
vorbereitet:
f.c.
zu markierendes Oligonukleotid 0,5 µM
10×PNK Reaktionspuffer A 1×
T4 PNK
10 u
[γ- 32 P]-ATP
50 µCi
f.v. 20 µl
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