Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

4 Methoden
Einbau von ddNTPs entstandenen Transkriptabbrüche.
Tabelle 4.6: 10×dNTP-Mix Zusammensetzungen
10×NTP-Mix 10×NTP-Mix 10×NTP-Mix 10×NTP-Mix
A C G T
dATP 10 mM 2,5 µl 10 µl 10 µl 10 µl
dCTP 10 mM 10 µl 2,5 µl 10 µl 10 µl
dGTP 10 mM 10 µl 10 µl 2,5 µl 10 µl
dTTP 10 mM 10 µl 10 µl 10 µl 2,5 µl
4.1.3 Reverse Transkription
cDNA-Synthese
Durch die reverse Transkription von RNA wird komplementäre DNA (complementary DNA,
cDNA) hergestellt. Dieser Prozess wird im Folgenden als cDNA-Synthese bezeichnet. Zum
einen diente die cDNA-Synthese der Amplifikation der 3’-UTR-Sequenzen der Ziel-Gene
für die Klonierung der Reportergen-Konstrukte. Zum anderen wurde sie für anschließende
qPCR-Analysen (siehe 4.1.1) eingesetzt. Unter Verwendung des RevertAid First Strand
cDNA Synthesis Kits wurde die eingesetzte RNA zunächst mit dem verwendeten Primer
(oligo-dT oder random Hexamer) in einer 12 µl Reaktion für 10 min bei 70 °C denaturiert und
anschließend die weiteren Reaktionskomponenten hinzugefügt .
f.c.
Gesamtzell-RNA
200-1000 ng
oligo-dT- oder random Hexamer-Primer 5 µM
5×Reaktionspuffer 1×
dNTP-Mix
1 mM
RiboLock
20 u
M-MuLV Reverse Transkriptase
200 u
f.v. 20 µl
Es erfolgte eine Inkubation für 5 min bei 25 °C (nur bei Verwendung der random Hexamer-
Primer), 60 min bei 42 °C und abschließend 5 min bei 70 °C. Die cDNA wurde ggf. in H 2 O
verdünnt und dann bei -80 °C gelagert.
Primer-Extension
Die Spaltprodukte des RNA-Strukturprobings (siehe 4.2.15) wurden durch eine sogenannte
Primer-Extension Reaktion in cDNA Fragmente umgeschrieben. Dazu wurden 32 P-markierte
38