Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5.8 Untersuchungen im TCF21-System
plexe mit dem TCF21 200er G in vitro Transkript.
Die für das miRNA Annealing der Gesamtlänge und verkürzten TCF21 in vitro Transkripte
berechneten Ratenkonstanten sind in Tab. 5.18 vergleichend aufgeführt und weisen mit
Faktoren zwischen 1,1 und 1,2 nahezu identische Werte auf.
Tabelle 5.18: Vergleich der Ratenkonstanten des TCF21 miRNA-Annealings von Gesamtlänge und
verkürzten in vitro Transkripten in Anwesenheit von CTAB (siehe Abb. 5.50 und 5.53).
miRNA in vitro Transkript k in vitro Transkript k Faktor
miR-224 3’-UTR C 2,2·10 6 200er C 2,1·10 6 1,1
3’-UTR G 1,4·10 6 200er G 1,2·10 6 1,2
miR-224_SNP 3’-UTR C n.d. 200er C n.d. -
3’-UTR G 1,4·10 6 200er G 1,3·10 6 1,1
Im Gegensatz zu den Gesamtlänge TCF21 3’-UTR in vitro Transkripten war für die verkürzten
Varianten in Abwesenheit von CTAB keine Komplexbildung mit miR-224 und
miR-224_SNP zu detektieren (Daten nicht gezeigt). Eine Erklärung dafür bietet die von
Patzel et al. [166] untersuchte Längenabhängigkeit des RNA-RNA-Annealings. Die in Abwesenheit
von CTAB durchgeführten Analysen zeigten, dass mit zunehmender RNA-Länge
eine schnelleres Annealing zu verzeichnen ist.
Temperaturabhängigkeit des Annealings von TCF21 und miR-224
Im Folgenden wurde die Komplexbildung zwischen den TCF21-Varianten und der miR-224
bei unterschiedlichen Temperaturen näher untersucht. Anhand dessen wurden weitere thermodynamische
Parameter, wie z.B. die Aktivierungsenergie E A beider Annealing-Reaktionen
(TCF21 C mit miR-224 bzw. TCF21 G mit miR-224), bestimmt.
Die Analyse des Annealings der miR-224 an das TCF21 3’-UTR C bzw. G in vitro Transkript
bei unterschiedlichen Temperaturen zeigt, dass die Erhöhung der Reaktionstemperatur
mit einer gesteigerten Komplexbildung einhergeht. Für alle Temperaturen gilt, dass das
TCF21 C in vitro Transkript deutlich stärkere Komplexe mit der miR-224 bildet.
Diese Ergebnisse zeigen im Vergleich zu den vorherigen Annealing-Experimenten (siehe
5.50) deutlich stärkeren Absolutwerte der RNA-RNA-Komplexe. Eine mögliche Erklärung
dafür ist, dass für die Versuche unterschiedliche in vitro Transkript-Präparationen verwendet
wurden. Diese können unterschiedliche Transkript-Isoformen enthalten und somit die Umsatzunterschiede
erklären.
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