Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5.8 Untersuchungen im TCF21-System
Sekundärstruktur angenommen werden kann.
5.8.6 Untersuchungen zur Rolle des SNPs auf die siRNA-vermittelte
Regulation von TCF21
Zur Analyse des Einflusses des SNPs rs12190287 auf die siRNA-vermittelte Regulation von
TCF21 wurden die TCF21 3’-UTR Reporterplasmide mit siRNAs ko-transfiziert. Diese Untersuchungen
dienten der Fragestellung, ob für die siRNA-vermittelte Regulation der TCF21-
Varianten eine differentielle Struktur-Funktions-Beziehung beobachtet werden kann.
Die Ziel-Sequenz der verwendeten siRNAs ist identisch mit der der miR-224-Erkennungsstelle.
Die folgende Abbildung zeigt die Komplementaritäten zwischen TCF21- und siTCF21-
Varianten.
TCF21 C
5′...GCUGAGAACUUCGGUGACUUC...3′
| |||||||| | | | | | || ||| ||
siTCF21 C 3′ CGACUCUUGAAGCCACUGAAG 5′
ΔG = -43,0 kcal/mol
TCF21 G
5′...GCUGAGAACUUCGGUGAGUUC...3′
| |||||||| | | | | | || | | ||
3′ CGACUCUUGAAGCCACUGAAG 5′
ΔG = -39,1 kcal/mol
5′...GCUGAGAACUUCGGUGACUUC...3′
| |||||||| | | | | | || | | ||
siTCF21 G 3′ CGACUCUUGAAGCCACUCAAG 5′
ΔG = -37,0 kcal/mol
5′...GCUGAGAACUUCGGUGAGUUC...3′
| |||||||| | | | | | || | | | ||
3′ CGACUCUUGAAGCCACUCAAG 5′
ΔG = -43,0 kcal/mol
Abbildung 5.45: Komplementarität der TCF21-Varianten zur siTCF21 C und siTCF21 G. Die
siTCF21 C ist durch eine zur TCF21-Variante C 100 %-ige Komplementarität gekennzeichnet. Die
TCF21 G-Variante weist hingegen an Position 4 ausgehend vom 5’-Ende der siRNA einen G-G mismatch
auf. Durch Einführung eines G>C Basenaustausches an der Position 4 innerhalb des siTCF21
C guide Stranges wird die siTCF21 G generiert. Diese ist vollständig komplementär zur TCF21 G-
Variante, weist jedoch einen C-C mismatch mit der TCF21 C-Variante auf. Die angegebenen Bindungsenergien
wurden mittels RNAHybrid bestimmt.
TCF21 3’-UTR-Reporter wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen an siTCF21 C
bzw. siTCF21 G ko-transfiziert. Die Ergebnisse sind in Abb. 5.46 dargestellt. Für alle TCF21-
siRNA Kombinationen ist eine konzentrationsabhängige Hemmung der Luciferase-Aktivität
zu beobachten. Beide TCF21-Varianten werden von ihrer 100 % komplementären siRNA
stärker gehemmt, jedoch wird in Relation zum TCF21 G das TCF21 C in jeder siRNA-
Konzentrationsstufe stärker gehemmt. Ein Vergleich der siRNA-vermittelten Hemmung des
jeweiligen TCF21-Reporters, der einen mismatch zur entsprechenden siRNA aufweist (d.h
TCF21 G-siTCF21 C und TCF21 C-siTCF21 G), verdeutlicht, dass auch in diesem Fall die
siTCF21 C eine stärkere Repression der Luciferase-Aktivität verursacht.
117