Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

4.2 Nukleinsäureanalytische Methoden
4.2.6 RNA-Isolation
Isolation durch Phenol-Chloroform-Extraktion
Zur Reinigung von RNA nach in vitro Transkription (siehe 4.2.14) und RNA-Strukturprobing
(siehe 4.2.15) wurde das zu extrahierende Probenvolumen mit H 2 O auf 100 µl expandiert
und anschließend 100 µl Phenol-Chloroform (pH = 4,5) hinzupipettiert. Bei der RNA-Extraktion
aus Zellen wurde das Zellpellet mit 200 µl 1 % NP40 resuspendiert und anschließend mit
200 µl Phenol-Chloroform (pH = 4,5) versehen. Es folgten 2 min Schütteln und Zentrifugation
für mind. 5 min (45 min für Zell-RNA) bei 4 °C und 20.000×g. Die wässrige Phase wurde mit
100 µl (bzw. 200 µl für Zell-RNA) Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) gemischt, 2 min geschüttelt
und für mind. 5 min bei 4 °C und 20.000×g zentrifugiert. Dieser Vorgang wurde einmal
wiederholt. Abschließend erfolgte eine EtOH-Fällung der wässrigen Phase (siehe 4.2.7).
Isolation mittels RNA-Extraktions-Kit
Aus MCF-7 und Hec1A-Zellen wurde unter Verwendung des NucleoSpin ® RNA II - Kits RNA
extrahiert, um daraus die zur Amplifikation der 3’-UTR Sequenzen eingesetzte cDNA zu
generieren. Dazu wurden zunächst Aliquots aus 1 - 4 ·10 6 Zellen mittels 350 µl RA1 Lysepuffer
und 3,5 µl β-Mercaptoethanol lysiert. Anschließend erfolgte ein Homogenisieren durch
mehrfaches Aufziehen und Ablassen des Lysats durch eine 0,9 mm Kanüle. Es wurde weiter
nach Herstellerangaben verfahren und die RNA schließlich mit 40 µl H 2 O eluiert.
4.2.7 Fällung von Nukleinsäuren
Ethanol-Fällung
Die zu fällende, wässrige Probe wurde mit dem 0,1-fachen Volumen 3 M Natriumacetat
(pH 5,2) angesäuert, dann mit dem 2,5-fachen Volumen EtOH (100 %) versetzt und kräftig
gemischt. Nach der Lagerung für 30 min bei -80 °C oder über Nacht bei -20 °C wurde
die gefällte Nukleinsäure für mindestens 30 min bei 20.000×g und 4 °C zentrifugiert. Das
Präzipitat wurde zweimal mit 200 µl EtOH (70 %) gewaschen, luftgetrocknet und in Nukleasefreiem
H 2 O resuspendiert.
Isopropanol-Fällung
Die bei der Maxi-Präparation (siehe 4.2.4) eluierte Plasmid-DNA wurde mit Isopropanol ausgefällt.
Das mit dem 0,7-fachen Volumen an Isopropanol versetzte Eluat wurde kräftig gemischt
und 2 min bei Raumtemperatur belassen. Anschließend erfolgte eine 45 minütige
Zentrifugation bei 12.000×g und 4 °C gefolgt von zweimaligem Waschen mit 70 %-igem
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