Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

6.6 Erkenntnisse für zukünftige Analysen von miR-SNPs
identische Sekundärstrukturen vorhergesagt (siehe Tab. 5.9) wohingegen für die Vorhersagen
aller anderen analysierten SNPs eine mit dem SNP korrelierte Strukturveränderungen
beobachtet werden konnten. Diese Strukturunterschiede konnten in experimentellen Analysen
der näher untersuchten miR-SNPs, MRAS rs9818870 und TCF21 rs12190287, bestätigt
werden (siehe Kap. 5.6 und 5.8).
Die Vorhersage der Sekundärstruktur kann somit als pre-screening Methode eingesetzt
werden, um den Einfluss eines SNPs auf die lokale RNA-Struktur und damit seine Bedeutung
für die miRNA-vermittelte Regulation zu analysieren. Eine deutliche Erleichterung der
im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten mfold-Analysen ergab sich aus der automatisierten
Faltung (programmiert von Simon Dornseifer, Mitarbeiter im IMM). Nach Eingabe der RNA-
Sequenz, der Fenstergröße und der Schrittweite wurden sämtliche sich daraus ergebenden
Sekundärstrukturen automatisch berechnet (siehe Abb. 4.4). Am IMM existiert zudem ein
Algorithmus, mit dem die Positionierung einer Base in einem gepaarten vs. ungepaarten
Zustand bestimmt werden kann. Diese Art der Auswertung ist deutlich weniger zeitintensiv,
kam im Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht zur Anwendung. Die manuelle Auswertung erfolgte
visuell, sodass jede Struktur an der SNP-Position und der miRNA Bindestelle analysiert
werden konnte. Dies ermöglichte eine detaillierte Aussage zu den an den jeweiligen RNA-
Positionen von Interesse vorliegenden Strukturelementen. Zur Vereinfachung dieser Vorgehensweise
wäre die Programmierung eines entsprechenden Algorithmus, mit dem sich einzelne
Strukturelemente bestimmen lassen, sehr hilfreich.
Sind für eine Ziel-RNA eine Vielzahl an SNPs beschrieben, so gestaltet sich eine vergleichende
mfold-Analyse sehr schwierig (siehe Kap. 5.7). Dies gilt ebenso für weitere Analyse-
Methoden, wie etwa eine vergleichende miRNA Ko-Tranfektions- oder Strukturprobing-Analyse.
6.6.2 Auswahl von Sequenzen für Reportergen-Konstrukte
Zur experimentellen Validierung von miRNA Bindestellen ist die Durchführung von Reportergen-Assays
weitverbreitet, jedoch existieren keine allgemeingültigen Vorgehensweisen für
die Auswahl der klonierten Ziel-Gen Sequenzabschnitte. Im Zuge dieser Arbeit wurden Analysen
im AGTR1-miR-155-System durchgeführt, bei denen zunächst Reporter-Konstrukte
zur Anwendung kamen, die ausschließlich die Sequenz der miRNA Bindestelle enthalten.
Anschließend erfolgten Analysen mittels Reporter-Konstrukten mit gesamter AGTR1 3’-UTR
Sequenz. Es zeigten sich deutliche Unterschiede in der durch die miR-155 Varianten vermittelten
Regulation der verschiedenen Reporter-Längen. Eine diesbezüglich mögliche Interpretation
ist, dass die AGTR1-miR-155-Interaktion in vivo stark von der authentischen
AGTR1-Sekundärstruktur abhängt. Das Einbringen einer kurzen Ziel-Sequenz in die MCS
bedeutet, dass der Hauptteil der sich ausbildenden Sekundärstruktur von der Sequenz des
Reportergens bestimmt ist. Dies kann zur Folge haben, dass die RNA-Struktur sehr stark
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