Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

4 Methoden
4.2.15 RNA-Strukturprobing
Allgemeines
Das im folgenden Abschnitt beschriebene RNA-Strukturprobing diente zur vergleichenden
Strukturanalyse von RNAs mit polymorphen Sequenzen. In Tab. 4.9 sind die dazu verwendeten
Agenzien aufgeführt. Neben der enzymatischen Spaltung der RNA durch die RNase T1
wurde auch eine chemische Hydrolyse mit Blei(II)acetat (im Folgenden mit Pb 2+ bezeichnet)
durchgeführt.
Tabelle 4.9: Spezifität verwendeter Probing-Agenzien.
Hydrolyse-Art Agens Spezifität
enzymatisch RNase T1 ss G
chemisch Pb 2+ ss A, C, G, U
A
RNA
B
enzymatische (RNase) oder chemische (Pb 2+ ) Hydrolyse
Denaturierung der Spaltprodukte
Annealing der 32 P-markierten Sonde
C
Reverse Transkription
32 P-markierte cDNA Fragmente
Auftrennung auf Sequenziergel
Phosphorimaging
RNA
Spaltstelle
32 P Sonde
cDNA
Abbildung 4.2: Schematischer Ablauf des RNA-Strukturprobings. (A) zeigt die lineare Versuchsabfolge
während des Probings. Wie in (B) durch die Pfeile angedeutet, werden einzelsträngige Bereiche
der RNA durch enzymatische oder chemische Hydrolyse gespalten. (C) zeigt das schematische
Prinzip der Primer-Extension der radioaktiv markierten Sonde. Die RNA-Spaltprodukte sind durch
schwarze horizontale Linien und die Spaltstellen durch vertikale Pfeile angedeutet. Die Sonde bindet
an den komplementären Bereich der RNA und wird durch reverse Transkription bis zur Spaltstelle
verlängert. Die so gebildeten unterschiedlichen cDNA-Fragmente geben Aufschluss über die Spaltstellen
und somit über die für Hydrolyse zugängliche Bereiche in der RNA.
Die Abb. 4.2 zeigt den schematischen Versuchsablauf des Strukturprobings. Zunächst
wurden in vitro Transkripte hergestellt (siehe 4.2.14), diese mit H 2 O auf eine Konzentration
von 1 µM verdünnt und dann mit RNase T1 oder Pb 2+ hydrolysiert. Die Spaltprodukte wurden
mittels EtOH-Fällung isoliert und anschließend durch Primer-Extension mit 32 P-markierten
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