Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

4.2 Nukleinsäureanalytische Methoden
Sonden (siehe 3.5.4), die stromabwärts vom SNP bzw. der miRNA Erkennungsstelle binden,
in cDNA umgeschrieben (siehe 4.1.3). Im Anschluss erfolgte deren gelelektrophoretische
Auftrennung durch denaturierende PAGE auf einem Sequenziergel (siehe 4.2.2) sowie deren
Detektion mittels Phosphorimaging (siehe Abb. 4.2). Im Folgenden werden die Reaktionen
der einzelnen RNA-Spaltungen im Detail beschrieben.
RNase T1-Spaltung
Die Endoribonuklease RNase T1 spaltet RNA spezifisch an ungepaarten Guaninen. In einer
5 µl Reaktion wurde zunächst jeweils 1 pmol in vitro Transkript in 1×Faltungspuffer für 10 min
bei 70 °C denaturiert und im Heizblock langsam bei Raumtemperatur renaturiert. Nach Zugabe
von 1 µg tRNA, 0,5 µl 10×Faltungspuffer und 2,5 µl H 2 O wurde 1 µl vorverdünnte
RNase T1 zugegeben, sodass die in vitro Transkripte mit 0, 0,25, 1 oder 2 units RNase T1
für jeweils 4 min bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Nach Expansion des Volumens auf
100 µl mit H 2 O wurde die gespaltene RNA mittels Phenol-Chloroform extrahiert (siehe 4.2.6)
und anschließend durch EtOH-Fällung (siehe 4.2.7) unter Zugabe von 1 µg tRNA als Fällhilfe
gewonnen.
Bleiacetat-Spaltung
Blei(II)acetat erzeugt im Gegensatz zu der verwendeten RNase eine Spaltung der RNA in
ungepaarten Bereichen ohne eine Präferenz für eine bestimmte Base. In einem 5 µl Reaktionsvolumen
wurde zunächst jeweils 1 pmol in vitro Transkript in 1×Faltungspuffer für 10 min
bei 70 °C denaturiert und im Heizblock langsam bei Raumtemperatur renaturiert. Anschließend
wurde der Reaktionsansatz mit 1 µl 10×Pb-Puffer und 4 µl H 2 O expandiert und für
15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 5 µg tRNA wurde Pb 2+ zupipettiert,
sodass in einem 15 µl Volumen Endkonzentration von 0, 10, 20 oder 40 mM vorlagen. Es
folgte eine 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Anschließend wurde die Reaktion
durch 5 µl EDTA (0,1 M) und 60 µl EtOH (100 %) gestoppt und die gespaltene RNA mittels
EtOH-Fällung (siehe 4.2.7) unter Zugabe von 1 µg tRNA als Fällhilfe gewonnen (adaptiert
nach [126]).
4.2.16 RNA-RNA-Annealing
Annealing
Durch RNA-RNA-Annealing Experimente wurde das Bindungsverhalten zwischen einem in
vitro Transkript und einer miRNA bzw. siRNA untersucht. Dabei wurde analysiert, ob kurze
RNAs (miRNA bzw. siRNA guide-Stränge) unterschiedlich stark bzw. schnell an Ziel-RNAs,
die sich nur in einem nt unterscheiden, binden (schematisch siehe Abb. 4.3).
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