Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5.8 Untersuchungen im TCF21-System
A
TCF21 3′-UTR
Pos. 1-2393
TCF21 3′-UTR
GGG
SNP
B
TCF21 3′-UTR
Pos. 126-325
TCF21 200er
GGG
SNP
Abbildung 5.47: Schematische Darstellung der verwendeten TCF21 in vitro Transkripte. (A) Gesamtlänge
und (B) verkürztes TCF21 in vitro Transkript.
Zunächst wurden die Gesamtlängen-in vitro Transkripte eingesetzt, um eine vergleichende
RNA-Hydrolyse der TCF21 3’-UTR C-bzw. G-Variante vorzunehmen. Wie zuvor beschrieben,
wurden dafür die in vitro Transkripte durch chemische und enzymatische Hydrolyse
gespalten, die Spaltprodukte in cDNA umgeschrieben und gelelektrophoretisch aufgetrennt
(siehe 4.2.15). Die Ergebnisse sind in der Abb. 5.48 gezeigt.
Betrachtet man zunächst die Ergebnisse der Pb 2+ -Hydrolyse (Abb.-Teil A), so sind deutliche
Unterschiede zwischen den beiden TCF21-Varianten zu erkennen. Die RNA-Positionen
1068-1069 der TCF21 3’-UTR G- in Relation zur C-Variante werden sichtlich stärker gespalten.
Demgegenüber ist das 3’-Ende der miR-224 Bindestelle (Positionen 1058-1064)
des TCF21 3’-UTR C in vitro Transkripts wesentlich zugänglicher für eine Pb 2+ -vermittelte
Hydrolyse. Diese Beobachtungen bestätigen die mittels mfold erzielten Ergebnisse zu den
TCF21-Sekundärstrukturen (siehe 5.35). Hier wurde dieser Abschnitt für die C-Variante innerhalb
eines großen Loops, die G-Variante innerhalb eines Stems vorhergesagt. Das 5’-
Ende der TCF21 G miR-224-Erkennungssequenz (Positionen 1045-1049) weist zusätzliche,
schwache Pb 2+ -induzierte Spaltprodukte auf.
Auch die RNase T1-vermittelte RNA-Hydrolyse (Abb.-Teil C) zeigte Unterschiede in den
Spaltmustern beider TCF21 3’-UTR-Varianten. Die gesamte Auftrennung der Hydrolyse mit
der größten eingesetzten RNase T1-Menge (2 u) zeigt für das TCF21 3’-UTR G in vitro
Transkript deutlich schwächere Spaltprodukte. Dies lässt eine gesteigerte Hydrolyse der initialen
Spaltprodukte vermuten. Daher werden im Folgenden ausschließlich die Ergebnisse
der mittels geringerer RNase T1-Mengen (0,25 und 1 u) durchgeführte Hydrolyse betrachtet.
Während die Positionen 1041 und 1046 noch vergleichbare Intensitäten der Spaltprodukte
aufweisen, wird an Position 1053 bereits bei kleinster RNase T1-Menge (0,25 u) ein deutlich
stärkeres Spaltprodukt für die TCF21 G-Variante detektiert. Die Spezifität der RNase T1,
die RNA ausschließlich an Guaninen zu spalten, erklärt das Auftreten eines zusätzlichen
Spaltproduktes an der SNP-Position (1058) für das TCF21 G in vitro Transkript. Zudem ergibt
die Hydrolyse des Guanins an Position 1070 ein für die C-Variante des TCF21 in vitro
Transkripts stärkeres Spaltprodukt.
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