Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5.3 Untersuchungen im AGTR1-System
Während die AGTR1 3’-UTR C-Variante faktisch keine Hemmung der Reporteraktivität durch
die pre-miR-155 zeigt, steht die Restaktivität der kurzen AGTR1 C-Variante bei 83 %.
**
120
110
110
100
81
83
FL/RL in %
90
80
72
AGTR1 A
AGTR1 C
70
60
50
kurz
pre-miR-155
3′-UTR
Abbildung 5.5: Hemmung der kurzen und langen AGTR1-Reporter durch pre-miR-155. HeLa Zellen
wurden im 24 well Format mit je 100 ng AGTR1 Reporterplasmid (pMIR-Luci AGTR1 kurz A
bzw. C oder pMIR-Luci AGTR1 3’-UTR A bzw. C), 10 ng pRL-CMV-Plasmid und 0-150 nM pre-miR-
155 4 ko-transfiziert. Nach 24 h wurden die Zellen lysiert und anschließend die Luciferase-Aktivität
gemessen. Die relativen firefly Luciferase-Aktivitäten (FL/RL) wurden auf Ansätze ohne pre-miRNA
(nur Plasmid-DNA) normiert. Dargestellt sind die Mittelwerte und die Standardabweichungen von vier
unabhängigen Experimenten. ** p≤0.001
Im Hinblick auf die differenzierten Ergebnisse für die kurzen und langen Reporter ist zu
berücksichtigen, dass die Reporter-Konstrukte große Unterschiede bezüglich der Länge des
authentischen AGTR1 3’-UTR Sequenzabschnittes aufweisen. Es ist denkbar, dass sich lange
Bereiche einer 3’-UTR Sequenz innerhalb rekombinanter Konstrukte ähnlich zur authentischen
mRNA falten. Die Wahrscheinlichkeit einer solchen Ähnlichkeit wird durch Einfügen
kurzer Sequenzabschnitte verringert. Das bedeutet, dass die lokale Sekundärstruktur
der miR-155 Bindestelle der kurzen Reporter-Transkripte stärker durch die firefly Luciferase
mRNA Sequenz beeinflusst sein könnte, und sich die miR-155 Bindestellen der langen
Reporter-Transkripte mit größerer Ähnlichkeit zur authentischen AGTR1 mRNA falten könnte.
Das Vorliegen unterschiedlicher struktureller Kontexte kann des Weiteren zu Unterschieden
in der Zugänglichkeit der miR-155 Bindestelle führen. Zur Untersuchung des Einflusses
der Länge der authentischen Sequenz auf die miRNA-Regulation wurden daher die kurzen
und langen Reporter in weiteren Transfektions-Experimenten parallel analysiert.
Das Einbringen von chemischen Modifikationen in RNA-Oligonukleotide dient zur Erhöhung
der Stabilität des synthetisch hergestellten miRNA-Doppelstranges und zur Verstär-
4 Da nicht bei allen Experimenten eine Konzentrations-abhängige Hemmung zu beobachten war, ergeben sich
die Mittelwerte aus der jeweils stärksten Hemmung der relativen Luciferase-Aktivität und somit aus unterschiedlichen
Konzentrationen an pre-miR-155.
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