Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5.8 Untersuchungen im TCF21-System
5.8.11 Zusammenfassung und Fazit der TCF21-Analysen
Die Assoziation der TCF21 C-Variante des SNPs rs12190287 mit CAD wurde mittels GWAS
identifiziert [23]. Der SNP ist in der 3’-UTR der TCF21 mRNA innerhalb einer Bindestelle für
die miR-224 lokalisiert und die TCF21 C-Variante weist einen C-G match an Position 4 ausgehend
vom 5’-Ende der miRNA auf, wohingegen die G-Variante durch einen G-G mismatch
an selbiger Position gekennzeichnet ist.
Die systematische Vorhersage der TCF21 Sekundärstrukturen wies deutliche Unterschiede
bezüglich der lokalen Struktur um den SNP bzw. die miR-224 Bindestelle auf. Die SNP-
Position der TCF21 C-Variante ist fast ausschließlich in einem Loop und die der G-Variante
vornehmlich in einem Stem lokalisiert. Diese Struktur-Elemente konnten in allen vier zur
Faltung verwendeten Fenstergrößen (100, 200, 400 und 800 nt) beobachtet werden. Daher
erfolgte eine weitestgehend parallele Analyse von TCF21 3’-UTR Gesamtlänge und auf 200
nt verkürzten TCF21-RNAs.
Eine experimentelle Bestätigung von strukturellen Unterschieden beider TCF21-Varianten
in der SNP-Region lieferten die Ergebnisse der Pb 2+ - bzw. RNase T1-vermittelten RNA-
Hydrolyse. Die Untersuchung der miRNA-vermittelten Repression von TCF21 Luciferase
Reporterkonstrukten durch die miR-224 und die miR-224_SNP in Zellkulturversuchen ergab,
dass die TCF21 G-Reporteraktivität von beiden miRNA-Varianten reprimiert wurde, während
die der TCF21 C-Variante nur miR-224-vermittelt gehemmt wurde. Eine Erklärung für die differenzierte
Hemmung konnten die zusätzlich durchgeführten RNA-Annealing-Experimente
aufzeigen. So war eine stark verminderte RNA-RNA-Wechselwirkung zwischen TCF21 C
und miR-224_SNP gegenüber den anderen RNA-miRNA-Kombinationen zu beobachten.
Für die TCF21 C-Variante waren nur Komplexe mit der miR-224 für die G-Variante hingegen
Komplexe mit beiden miR-224-Varianten detektierbar.
Fazit
Die Daten der TCF21-Analysen zeigen, dass der SNP rs12190287 ein weiteres Beispiel für
einen miR-SNP darstellt, der mit strukturellen Änderungen der Ziel-RNA korreliert ist. Die
TCF21-Versuche zeigen weiterhin, dass anhand einer systematischen RNA-Strukturvorhersage
eine geeignete Auswahl von RNA-Ausschnitten erfolgen kann, sodass Strukturunterschiede
und die damit einhergehenden funktionellen Unterschiede zweier RNA-Varianten
auch mit verkürzten Ziel-Gen 3’-UTR Sequenzen nachgewiesen werden können. Anhand
von in vitro Annealing-Versuchen konnten unterschiedliche RNA-RNA-Wechselwirkungen
zwischen TCF21- und miR-224-Varianten detektiert werden, die ursächlich für eine differentielle
miRNA-vermittelte Regulation beider TCF21-Varianten zu sein scheint. Weiterführende
detaillierte mechanistische Betrachtungen sind in der Diskussion aufgeführt (siehe Kap. 6.2,
6.4.2 und 6.6.2).
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