Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

4 Methoden
4.3.5 Dual Luciferase-Assay
Die Lysate der transfizierten Zellen (siehe 4.3.4) wurden unter Verwendung des Dual Luciferase
® Reporter Assay Systems auf ihre firefly und Renilla Luciferase-Aktivität hin analysiert.
Dazu wurden die Lysate zuvor in 96 well Mikroplatten übertragen. Die entsprechende Messung
erfolgte am anthos Lucy3 Luminometer.
4.4 Computergestützte Methoden und Auswertungen
4.4.1 RNA-Strukturvorhersage mittels mfold
Zur Vorhersage der RNA-Struktur diverser mRNAs bzw. 3’-UTRs wurde die mfold Software
[131, 132] verwendet. Dabei wurde eine RNA-Sequenz eingelesen und die fünf energieärmsten
Strukturen berechnet. Die Anwendung von mfold wurde freundlicherweise von Herrn S.
Dornseifer modifiziert, um mit der Software der Accelrys Genetics Computer Group arbeiten
zu können. Dies ermöglichte eine Automatisierung der Strukturberechnung. Nach Eingabe
der RNA-Struktur und der gewünschten Fenstergröße sowie Schrittweite (siehe Abb. 4.4)
konnten so sich alle hieraus ergebenden Strukturen automatisch bestimmt werden.
mRNA
SNP
500 1000 1500 2000 2500
Fenstergröße
Fenstergröße 800
Schrittweite
Fenstergröße 1400
Abbildung 4.4: Schematische Darstellung der systematischen RNA-Sekundärstrukturanalyse mittels
mfold. Ausgehend von der Ziel-Gen mRNA-Sequenz und der Position des SNPs wurden systematisch
für Ausschnitte der RNA die fünf energieärmsten, d.h. thermodynamisch stabilsten Strukturen
berechnet. Die automatisierten Strukturberechnungen wurden durch zwei Parameter bestimmt: (I) die
Fenstergröße, d.h. der Größe des Sequenz-Ausschnittes und (II) die Schrittweite mit der sukzessive
die Ausschnitte über den SNP-Bereich laufen.
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