Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

4.2 Nukleinsäureanalytische Methoden
versetzt. Dazu wurden zunächst DH5α oder BL21-DE3 Bakterien in 1 l LB Medium bei 37 °C
bis zu einer OD von ca. 0,6 kultiviert, auf vier 250 ml Zentrifugationsröhrchen verteilt und
anschließend 20 min bei 5.000×g und 2 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen
und jedes Bakterienpellet in 250 ml Eiswasser resuspendiert und erneut zentrifugiert. Dieser
Vorgang wurde einmal wiederholt. Je zwei der vier Bakterienpellets wurden dann in 40 ml
10 %-igem Glycerin vereint, 10 min bei 5.000×g und 2 °C zentrifugiert, in 1 ml 10 %-igem
Glycerin resuspendiert und abschließend in 90 µl Aliquots abgefüllt. Die elektrokompetenten
E. coli Bakterien wurden bei -80 °C gelagert.
4.1.6 Kryokonservierung von E.coli
Zur Kryokonservierung von Bakterien-Stämmen oder -Klonen wurden 500 µl einer Übernachtkultur
mit 500 µl Glycerin (87 %) gemischt und bei -80 °C gelagert.
4.2 Nukleinsäureanalytische Methoden
4.2.1 Konzentrationsbestimmung
Synthetisierte Oligonukleotide sowie während dieser Arbeit hergestellte Nukleinsäuren
(PCR-Produkte, Plasmid-DNA, in vitro Transkripte) wurden, soweit nicht anders angegeben,
in Nuklease-freiem H 2 O gelöst und deren Konzentration mittels Spektralphotometer bestimmt.
Die Berechnung der Konzentration c erfolgte durch Absorptionsmessung bei 260 nm
(A 260 ) gemäß des Lambert-Beerschen Gesetzes:
A 260 = ε · c · d ⇔ c = A 260
ε · d
(4.1)
ε = molarer Extinktionskoeffizient in cm -1 M -1
d = Schichtdicke in cm
Der Extinktionskoeffizient ist abhängig von Länge und GC-Gehalt des Oligonukleotids.
Der Wert für ein 20-mer DNA-Oligonukleotid liegt bei etwa 20.000 cm -1 M -1 . Für Plasmid-
DNA und langkettige RNA wurde die Konzentration durch folgende Näherung bestimmt: eine
A 260 von 1 entsprechen 50 µg/ml doppelsträngiger DNA bzw. 40 µg/ml RNA. Die Konzentration
c (in µM) der kurzen, einzelsträngigen Oligonukleotide (Primer, siRNA- und miRNA-
Einzelstränge) wurde mittels folgender Formel bestimmt:
c = A 260
ε
· 10 6 (4.2)
Zusätzlich zur Konzentration wurde die Reinheit der Nukleinsäuren durch Messung des
Quotienten A 260 /A 280 bestimmt.
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