Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5.8 Untersuchungen im TCF21-System
G trotz mismatch zu jedem Zeitpunkt der Probeentnahme stärker in Bezug auf die Bindung
der 100 %-ig komplementären siTCF21 G an das TCF21 G in vitro Transkript ist.
Wie in der Tab. 5.20 dargestellt, spiegeln sich die prozentualen Unterschiede in der Komplexbildung
auch in den ermittelten Geschwindigkeitsskonstanten der RNA-RNA-Assoziation
wider. Für die Interaktion mit beiden siRNAs ist k bei Vorliegen des TCF21 C in vitro Transkripts
größer. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das TCF21 C in vitro Transkript eine
bessere Zugänglichkeit für die eingesetzten siRNAs aufweist.
Tabelle 5.20: Ratenkonstanten des Annealings von TCF21 3’-UTR und siTCF21.
siRNA in vitro Transkript k (M -1 s -1 )
siTCF21 C TCF21 3’-UTR C 8,0·10 4 ± 2,4·10 3
TCF21 3’-UTR G 7,0·10 4 ± 3,3·10 3
siTCF21 G TCF21 3’-UTR C 4,0·10 4 ± 2,1·10 3
TCF21 3’-UTR G 3,3·10 4 ± 2,3·10 3
An dieser Stelle wird auf die im Abschnitt 5.8.6 beschriebenen Transfektionsexperimente
verwiesen. Die Daten der Ko-Transfektion des TCF21 3’-UTR C Reporters und der siTCF21
C wiesen aus allen Kombinationen der TCF21- und siTCF21-Varianten für jede siRNA-
Konzentration die stärkste Hemmung auf. Die deutlich schwächere Komplexbildung beider in
vitro Transkripten mit der siTCF21 G liefert somit eine Erklärung für die schwächere siTCF21
G-vermittelte Repression der Reporter-Aktivitäten.
Annealing von siRNAs an verkürzte TCF21 in vitro Transkripte
In Analogie zu den vorangegangenen Experimenten wurden entsprechende Versuche durchgeführt,
um die RNA-RNA-Interaktion verkürzter TCF21 in vitro Transkripte mit den siTCF21-
Varianten näher zu analysieren. In der Abb. 5.58 sind die Ergebnisse möglicher Kombinationen
aus TCF21 200er in vitro Transkript- und siTCF21-Variante dargestellt.
Wie bereits zuvor für die Reaktionen mit den TCF21 3’-UTR in vitro Transkripten können
auch hier deutliche Unterschiede zwischen den Komplexen mit der siTCF21 C bzw. siTCF21
G beobachtet werden. Letztere bildet auch mit den verkürzten in vitro Transkripten deutlich
schwächere Komplexe. Zu jedem Zeitpunkt der Probenentnahme bildet das 200er C in vitro
Transkript in Relation zur TCF21 G-Variante stärkere Komplexe mit beiden siRNAs.
Ein Vergleich der Ratenkonstanten der TCF21 in vitro Transkript-Längen ist in der Tab.
5.21 aufgeführt und zeigt, dass das siTCF21 C-Annealing etwa 5-fach und das siTCF21
G-Annealing sogar ca. 10-fach schneller an die Gesamtlänge in vitro Transkripte verläuft.
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