Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5 Ergebnisse
Die TCF21 G-Variante hingegen zeigt keine unterschiedliche Regulation durch die miR-224
bzw. miR-224_SNP. Für beide miRNAs war keine Hemmung auf Transkriptebene und eine
vergleichbar schwache Hemmung auf Proteinebene zu verzeichnen.
Untersuchungen mit verkürzten TCF21 Reportergen-Konstrukten
Mit Hilfe von weiteren Transfektions-Experimenten wurde analysiert, ob die für die TCF21
3’-UTR Gesamtlänge Reporter-Konstrukte erhaltenen Ergebnisse mit den verkürzten Reporter-Konstrukten
reproduzierbar sind. Die Auswertung der miR-224- bzw. miR-224_SNP-vermittelten
Repression der kurzen TCF21-Reporter erfolgte ausschließlich auf Proteinebene,
d.h. nur mittels Luciferase-Aktivitätsmessung. Die Ergebnisse sind in der Abb. 5.44 gezeigt.
Es wird ersichtlich, dass auch die verkürzten TCF21-Varianten Unterschiede in ihrer Regulierbarkeit
aufweisen. Die TCF21 C-Variante wird differentiell durch beide miRNAs gehemmt.
Die TCF21 G-Variante hingegen zeigt eine nur geringfügig unterschiedliche Hemmung durch
beide miRNAs.
140
120
107
FL/RL in %
100
80
60
88 85
88
miR-224
miR-224_SNP
40
20
0
C
TCF21 200er
G
Abbildung 5.44: miRNA-vermittelte Hemmung der verkürzten TCF21-Reporter auf Proteinebene.
Die verkürzten TCF21 C- und G-Reporterplasmide wurden in HeLa-Zellen (96-well Format, 10 ng
Plasmid-DNA pro well) jeweils mit 50 nM miR-224 bzw. miR-224_SNP ko-transfiziert. Nach einer 24-
stündigen Inkubation wurden die Zellen geerntet und die Luciferase-Reporteraktivitäten gemessen.
Die relativen firefly Luciferase-Aktivitäten (FL/RL) wurden auf Ansätze ohne miRNA (nur Plasmid-
DNA) normiert. Gezeigt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus drei unabhängigen Experimenten.
Zusammen mit den Ergebnissen der Gesamtlänge TCF21 Reporter-Konstrukten weisen
die Analysen zur miRNA-vermittelten Regulation von TCF21 darauf hin, dass die beobachteten
Unterschiede nicht ausschließlich anhand der in Abb. 5.33 gezeigten Bindungsenergien
zwischen mRNA und miRNA erklärt werden können, sondern ein zusätzlicher Einfluss der
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