Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

A.1 PCR-Details
Für jede der durchgeführten Mutagenese-PCRs wurde die folgende Reaktion mit denen in
Tab. A.5 aufgelisteten Templates und Primern angesetzt:
Tabelle A.6: Allgemeiner Reaktionsansatz der Mutagenese-PCR
f.c.
Template
3,6 fmol
5×Phusion HF Puffer 1×
dNTPs
0,8 mM
RV-Primer 0,1 µM
M-Primer 0,1 µM
Phusion Pol
2 u
f.v. 100 µl
Im Folgenden werden die PCR-Programme der Mutagenese-PCRs im Einzelnen aufgeführt.
Tabelle A.7: Mutagenese-PCR Programme AGTR1 und ESR1
PCR-Programm
AGTR1 ESR1
1. 1 × Denaturierung 98 °C 180 s 98 °C 180 s
2. 10 × Denaturierung 98 °C 10 s 98 °C 30 s
Annealing 64 °C 20 s 70 °C 30 s
Extension 72 °C 30 s 72 °C 60 s
3. 1 × finale Extension 72 °C 450 s 72 °C 450 s
Tabelle A.8: Mutagenese-PCR Programm MRAS und TCF21
PCR-Programm
MRAS TCF21
1. 1 × Denaturierung 98 °C 180 s 98 °C 180 s
2. 3 × Denaturierung 98 °C 10 s 98 °C 10 s
Annealing 63 °C 20 s 68 °C 20 s
Extension 72 °C 132 s 72 °C 90 s
3. 7 × Denaturierung 98 °C 10 s 98 °C 10 s
Annealing/Extension 72 °C 152 s 72 °C 110 s
4. 1 × finale Extension 72 °C 450 s 72 °C 450 s
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