Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5 Ergebnisse
diese experimentell nachweisbar sind.
Zunächst wurden die TCF21 3’-UTR in vitro Transkripte entweder mit der miR-224 bzw.
miR-224_SNP in Anwesenheit von CTAB inkubiert und in Hinblick auf die Bildung von Komplexen
zwischen RNA und miRNA zu unterschiedlichen Zeitpunkten analysiert (siehe Abb.
5.50).
A
[ 32 P]-miR-224 guide
[ 32 P]-miR-224_SNP guide
TCF21 3'-UTR C TCF21 3'-UTR G
-
- TCF21 3'-UTR C TCF21 3'-UTR G
0 10 30 120 0 10 30 120 0 10 30 120
t in s
Komplex
0 10 30 120 0 10 30 120 0 10 30 120
miRNA
B
12
10
8,6
8,6
% Komplex
8
6
4
2
2,3
1,3
5,5
2,0
3,9
4,5
1,8
0,81,0 0,8
0,9
3,6
1,0
3,4
TCF21 3′-UTR C
TCF21 3′-UTR G
0
0 10 s 30 s 120 s 0 10 s 30 s 120 s
miR-224
miR-224_SNP
Abbildung 5.50: Unterschiedliche Kinetik der Komplexbildung der TCF21 3’-UTR-Varianten mit miR-
224 und miR-224_SNP. TCF21 3’-UTR C bzw. G in vitro Transkripte (5 nM) wurden mit miR-224
bzw. miR-224_SNP guide Strang (0,5 nM) in Anwesenheit von 10 mM CTAB für 0-120 s bei 37 °C
inkubiert. Als Negativkontrolle diente jeweils ein Ansatz ohne in vitro Transkript. Die Reaktionen wurden
durch Zugabe von Stopp-Puffer und Einfrieren in flüssigem Stickstoff beendet und die Proben
bei 4 °C und 150 V auf einem 8 %-igen, nativen PAA-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. (A) Gele,
(B) Quantifizierung der Komplexe. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus
mindestens drei unabhängigen Versuchen.
Die Ergebnisse zeigen zeitabhängige Zunahmen an RNA-RNA-Komplexen mit deutlichen
Unterschieden zwischen den beiden TCF21-Varianten. Von allen möglichen Kombinationen
bildet das TCF21 C in vitro Transkript die stärksten Komplexe mit der miR-224. Unter Ver-
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