Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

4 Methoden
erneuter Zugabe von RV-Primer wird in einem abschließenden Schritt (ebenfalls 10 Zyklen
siehe Abb. 4.1 III) eine Vervielfältigung der gesamten punkt-mutierten Zielsequenz erreicht.
Tabelle 4.1: Programm der Mutagenese-PCR
Schritt Zyklen Vorgang Temperatur Zeit
1. 1 Denaturierung 98 °C 180 s
2. 10 Denaturierung 98 °C 10 s
Annealing 63 - 68 °C 20 s
Extension 72 °C 20 - 130 s
3. 1 finale Extension 72 °C 450 s
I
II
III
M
RV
FW M RV
RV
Abbildung 4.1: Schematischer Ablauf der Mutagenese-PCR. (I) Zunächst wird aus dem Template
mittels RV- und M-Primer ein punkt-mutiertes Zwischen-Produkt amplifiziert. (II) Nach Zugabe von
FW-Primer wird das punkt-mutierte PCR-Produkt der Gesamtlänge hergestellt. (III) Abschließend
wird nach Zugabe von weiterem RV-Primer das PCR-Produkt der Gesamt-Länge vervielfältigt. (verändert
nach [123])
Die durch die Mutagenese gewonnenen PCR-Produkte wurden durch gelelektrophoretische
Auftrennung aufgereinigt (siehe 4.2.8), mit den jeweiligen Restriktionsenzymen geschnitten
(siehe 4.2.5) und anschließend in die Ligationsreaktion eingesetzt (siehe 4.1.4).
Anfügen der T7 Promotor Erkennungssequenz
Zur in vitro Transkription der 3’-UTR eines Ziel-Gens wird ein Template benötigt, das die T7
Promotor Erkennungssequenz (TAATACGACT CACTATAGGG) enthält. Plasmid-Konstrukte des
pMIR-Report Vektors enthalten vor Beginn des firefly Luciferase Reportergens eine derartige
Erkennungsstelle, sodass in vitro Transkripte hergestellt werden konnten, bei denen die
Sequenz der firefly Luciferase der 3’-UTR Sequenz des Ziel-Gens voransteht. Dies erfolgte
für die ESR1 in vitro Transkripte. Die AGTR1 3’-UTR in vitro Transkripte hingegen wurden ohne
die vorangehende Luciferase-Sequenz hergestellt. Dazu wurde die pMIR-Report AGTR1
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