Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5.3 Untersuchungen im AGTR1-System
der 32 P-markierten miRNA guide Stränge.
Die Tatsache, dass keine Komplexe zwischen AGTR1 und miR-155 zu detektieren waren,
kann auf die relativ geringen Bindungsenergien (siehe Abb. 5.2) zwischen den beiden RNAs
zurückgeführt werden. Deren Werte ergeben sich aus dem Vorhandensein einer Vielzahl
von A-U Basenpaaren sowie G-U Wobble-Basenpaaren innerhalb der RNA-RNA-Wechselwirkung.
Im Vergleich zu G-C Basenpaaren bewirken diese aufgrund der thermodynamisch
instabileren Bindung eine schwächere Wechselwirkung beider RNAs. Dies kann eine Erklärung
dafür sein, dass derartige Komplexe unter Verwendung der angewandten Methodik
nicht detektierbar sind.
5.3.9 Kinetik der Bindung von siRNAs an AGTR1 RNA in vitro Transkripte
Nachdem eine Detektion der Komplexbildung zwischen den AGTR1 in vitro Transkripten
und partiell komplementären miR-155 bzw. miR-155_SNP guide Strängen mit Hilfe von
Annealing-Experimenten nicht möglich war, wurde ein Annealing mit den entsprechenden
siRNA guide Strängen durchgeführt. Wie in der Abb. 5.7 dargestellt, weisen die siRNAs
eine erhöhte Komplementarität zu den AGTR1 in vitro Transkripten auf. Die damit einhergehenden
deutlich erhöhten Bindungsenergien führen zu einer detektierbaren AGTR1-siRNA
Komplexbildung, wie der Teil A der Abb. 5.11 zeigt. Die Quantifizierung der Komplexe ist im
Teil B der Abb. 5.11 dargestellt. Diese zeigt eine annähernd identische Geschwindigkeit der
Komplexbildung beider in vitro Transkripte mit der siAGTR1 A. Dies lässt vermuten, dass der
mismatch zwischen AGTR1 A und siAGTR1 C die Komplexbildungsrate nicht beeinflusst.
Gegensätzlich dazu zeigt sich zu jedem Zeitpunkt der Probeentnahme eine stärkere Komplexbildung
der siAGTR1 C mit den AGTR1 3’-UTR C in vitro Transkripten. Vergleicht man
die Komplexbildung des AGTR1 A in vitro Transkripts mit den unterschiedlichen siRNAs, so
wird deutlich, dass mit beiden siRNAs nahezu identische Komplexe gebildet werden. Das
AGTR1 in vitro Transkript C hingegen bindet die beiden siRNAs unterschiedlich stark. Die
vollständig komplementäre siAGTR1 C wird im Verhältnis zur siAGTR1 A stärker gebunden.
In der Tab. 5.4 sind die Ratenkonstanten des AGTR1-siRNA-Annealings dargestellt. Die
durch vollständige Komplementarität beider RNAs gekennzeichneten Interaktionen weisen
jeweils die höheren Werte jedoch auch Unterschiede untereinander auf. Diese können z.B.
durch das Vorliegen verschiedener Basenpaare an der SNP-Position erklärt werden (A-U vs.
G-C).
Unter Verweis auf die siRNA Transfektions-Daten (siehe 5.3.5) wird deutlich, dass die
siAGTR1 A die Expression beide AGTR1 3’-UTR Varianten näherungsweise identisch reprimiert.
Die siAGTR1 C unterscheidet zwischen den AGTR1-Varianten derart, dass die 100 %
komplementäre Ziel-mRNA am stärksten gehemmt wird. Die Ergebnisse der Komplexbildung
im Verlauf des Annealing-Versuchs stellen somit eine schlüssige Erklärung der Repression
der firefly Luciferase Reporter-Aktivitäten im Transfektions-Experiment dar.
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