Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

A Anhang
A.1.3 PCRs zum Anfügen der T7 Promotor-Erkennungssequenz
Im folgenden Abschnitt werden die PCR-Reaktionen aufgeführt, mittels derer die Erkennungssequenz
des T7 Promotors an das 5’-Ende der jeweiligen 3’-UTR Sequenz angefügt
wurde.
Tabelle A.9: Details der AGTR1 T7-PCR
PCR-Ansatz f.c. PCR-Programm
pMIR AGTR1 3’-UTR A/C 93,75 ng 1. 1 × Denaturierung 98 °C 180 s
5×Phusion HF Puffer 1× 2. 5 × Denaturierung 98 °C 10 s
dNTPs 0,625 mM Annealing 67 °C 20 s
AGTR1 T7 FW 0,625 µM Extension 72 °C 90 s
AGTR1 RV SacI 2 0,625 µM 3. 30 × Denaturierung 98 °C 10 s
Phusion Pol 1,5 u Annealing/Extension 72 °C 50 s
f.v. 75 µl 4. 1 × finale Extension 72 °C 450 s
Tabelle A.10: Details der MRAS T7-PCR
PCR-Ansatz f.c. PCR-Programm
pmirGLO MRAS 3’-UTR C/T 62,5 ng 1. 1 × Denaturierung 98 °C 180 s
5×Phusion HF Puffer 1× 2. 3 × Denaturierung 98 °C 10 s
dNTPs 0,825 mM Annealing 63 °C 20 s
MRAS T7 FW 0,25 µM Extension 72 °C 132 s
MRAS RV SalI 0,25 µM 3. 32 × Denaturierung 98 °C 10 s
Phusion Pol 1u Annealing/Extension 72 °C 152 s
f.v. 50 µl 4. 1 × finale Extension 72 °C 450 s
Tabelle A.11: Details der TCF21 T7-PCR
PCR-Ansatz f.c. PCR-Programm
pmirGLO TCF21 3’-UTR C/G 62,5 ng 1. 1 × Denaturierung 98 °C 180 s
5×Phusion HF Puffer 1× 2. 5 × Denaturierung 98 °C 10 s
dNTPs 0,8 mM Annealing 66 °C 20 s
TCF21 T7 FW 0,325 µM Extension 72 °C 90 s
TCF21 RV SalI 0,325 µM 3. 30 × Denaturierung 98 °C 10 s
Phusion Pol 1 u Annealing/Extension 72 °C 110 s
f.v. 50 µl 4. 1 × finale Extension 72 °C 450 s
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