Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

4 Methoden
4.2.2 Elektrophoretische Auftrennung
Zur Auftrennung von Nukleinsäuren wurden die im Folgenden beschriebenen elektrophoretischen
Methoden angewandt. Die Detektion der Nukleinsäuren erfolgte gemäß den Ausführungen
im Abschnitt 4.2.3.
Polyacrylamid-Gelelektrophorese allgemein
Zur Auftrennung mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) wurden Gele mit dem gewünschten
Polyacrylamid (PAA)-Gehalt in 1×TBE aus Acrylamid/Bisacrylamid (19:1, v/v)
hergestellt. Die Polymerisation erfolgte durch Zugabe von APS (0,1 % (w/v)) und TEMED
(0,1 % (v/v)). Als Laufpuffer wurde 1×TBE verwendet.
Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Zur Auftrennung kurzer Oligonukleotide wurde eine denaturierende PAGE unter Verwendung
harnstoffhaltiger PAA-Gellösungen (7 M oder 8 M Urea) durchgeführt. In Abhängigkeit des
Anwendungsbereiches kamen sowohl Multigele (0,1×11×12 cm) als auch Sequenziergele
(0,04×21×40 cm) zum Einsatz. Für erstgenannte erfolgte ein Gelvorlauf bei 300 V für 30
bis 45 min. Die Proben wurden anschließend bei 300 V für 45 bis 75 min elektrophoretisch
aufgetrennt. Die Sequenziergele hingegen wurden bei 80 W auf 52 °C vorgeheizt und die
Proben anschließend für 60 bis 70 min bei 80 W und 52 °C elektrophoretisch aufgetrennt.
Nach dem Gellauf wurden die Sequenziergele auf Blotting-Papier übertragen, mit Frischhaltefolie
abgedeckt und dann unter Vakuum bei 80 °C getrocknet.
Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Die Auftrennung der Oligonukleotid-Komplexe, z.B. doppelsträngige siRNAs und miRNAs
oder Komplexe aus in vitro Transkript und siRNA bzw. miRNA, erfolgte mittels nativer PAGE,
um eine Dissoziation der (partiellen) Doppelstränge zu verhindern. Dazu kamen Gele der
Größe 0,1×11×12 cm zur Anwendung. Der Gelvorlauf wurde bei 100 V und 4 °C für 30 bis
45 min durchgeführt, die Proben anschließend bei 4 °C und 150 V für ca. 2 h elektrophoretisch
aufgetrennt.
Agarose-Gelelektrophorese
Zur Auftrennung von längerkettigen DNAs und RNAs (≥ 100 bp bzw. nt) wurden, in Abhängigkeit
der Länge der zu untersuchenden Nukleinsäuren, Agaroselösungen unterschiedlicher
Agarosekonzentrationen (0,7 bis 1,5 %) in 1×TAE-Puffer hergestellt. Ethidiumbromid
(siehe 4.2.3) wurde auf dem Gelschlitten vorgelegt und mit der aufgekochten Agaroselösung
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