Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5.6.2 Bindungsenergien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
5.6.3 Sekundärstrukturvorhersage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
5.6.4 Klonierung von MRAS Reportergen-Konstrukten . . . . . . . . . . . . 93
5.6.5 Untersuchungen zur Rolle des SNPs auf die miRNA-vermittelte Regulation
von MRAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
5.6.6 RNA-Strukturprobing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
5.6.7 Kinetik der Bindung von miRNAs an MRAS RNA in vitro Transkripte . 97
5.6.8 Zusammenfassung und Fazit der MRAS-Analysen . . . . . . . . . . . 99
5.7 Untersuchungen im DHFR-System . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
5.7.1 Einführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
5.7.2 miR-24 Bindestellen in der DHFR 3’-UTR . . . . . . . . . . . . . . . . 100
5.7.3 Sekundärstrukturvorhersage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
5.7.4 Sequenzanalyse der DHFR 3’-UTR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
5.7.5 Zusammenfassung und Fazit der DHFR-Analysen . . . . . . . . . . . 103
5.8 Untersuchungen im TCF21-System . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
5.8.1 Einführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
5.8.2 Bindungsenergien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
5.8.3 Sekundärstrukturvorhersage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
5.8.4 Klonierung von TCF21 Reportergen-Konstrukten . . . . . . . . . . . . 109
5.8.5 Untersuchungen zur Rolle des SNPs auf die miRNA-vermittelte Regulation
von TCF21 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
5.8.6 Untersuchungen zur Rolle des SNPs auf die siRNA-vermittelte Regulation
von TCF21 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
5.8.7 RNA-Strukturprobing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
5.8.8 Kinetik der Bindung von miRNAs an TCF21 RNA in vitro Transkripte . 121
5.8.9 Annealing von miRNAs an TCF21 mit anschließendem Strukturprobing 130
5.8.10 Kinetik der Bindung von siRNAs an TCF21 RNA in vitro Transkripte . 131
5.8.11 Zusammenfassung und Fazit der TCF21-Analysen . . . . . . . . . . . 135
5.9 Tabellarische Übersicht ausgewählter Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . 136
6 Diskussion 137
6.1 Verfügbare Online-Tools zur Analyse von miR-SNPs . . . . . . . . . . . . . . 137
6.1.1 Einführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
6.1.2 miRNA-Sequenzen und Vorhersage von miRNA Bindestellen . . . . . 137
6.1.3 miR-SNP Datenbanken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
6.1.4 SNP Informationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
6.1.5 Konsequenzen für funktionelle Analysen von miR-SNPs . . . . . . . . 139
6.2 Einfluss SNP-induzierter RNA-Strukturänderungen auf die miRNA-Regulation 140
6.3 Beeinflussung der miRNA-Regulation durch RNA-bindende Proteine . . . . . 142
iv