Arbeit komplett 12.07.2003 komplett Annahmeste - ArchiMeD

8.1 Testmethoden 113
8.1 Testmethoden
Im Rahmen der Arbeit wurden folgende Testsysteme aus dem Arbeitskreis U. Pindur
angewandt:
• Bestimmung der Schmelztemperatur
• DNA Unwinding-Assay
• Topoisomerase I-Enzymhemmung
8.1.1 Thermische Denaturierung – Bestimmung der Schmelztemperatur
der DNA
Lösungen doppelsträngiger DNA ändern signifikant eine Reihe ihrer physikalischen
Eigenschaften, wenn sie z.B.
1) extremen pH-Werten
2) hohen Temperaturen
3) abnehmenden Dielektrizitätskonstanten, z.B. durch Zugabe von Alkoho-
len, Ketonen zum wäßrigen Medium
4) Harnstoff oder Amiden
ausgesetzt werden 140 .
Hierbei verringert sich u.a. die Viskosität der DNA-Lösung, nimmt die optische Dre-
hung in Richtung negativer Werte zu, erhöht sich die Schwebedichte, oder es erfolgt
ein sprunghafter Anstieg der Absorption bei λ = 260 nm. Man spricht von Denaturie-
rung der DNA, wobei die doppelhelicale DNA-Struktur durch Aufhebung der Wasser-
stoffbrückenbindungen zwischen den Basenpaaren und/oder durch den Abbau der
Staplungskräfte (hydrophobe Wechselwirkungen zwischen aufeinanderfolgenden
Basenpaaren) aufgebrochen wird. Dabei geht die native DNA in eine zufällig auf-
geknäulte Form über, die als Einstrang- oder denaturierte DNA bezeichnet wird.
Am einfachsten kann der Prozeß der DNA-Denaturierung durch UV-Spektroskopie
nachgewiesen werden, die sich durch hohe Empfindlichkeit, gute Reproduzierbarkeit
und verhältnismäßig geringen Aufwand auszeichnet. Hierbei wird der hyperchrome
Effekt ausgenutzt, unter dem ein Anstieg der UV-Absorption bei gleichbleibender
Wellenlänge verstanden wird. Die Hyperchromie bei der DNA-Denaturierung erklärt
sich aus der Tatsache, daß mit zunehmender Temperatur die elektronischen Wech-
selwirkungen zwischen den gestapelten Basen der nativen Doppelhelix-Struktur auf-
gehoben werden, was einen Verlust des Ordnungsgrades bedeutet. In dieser weni-
ger behinderten Form können sich nun die Basen weiter voneinander trennen, wo-
140 Mandel, M.; Marmur, J.; Grossmann, L.; Moldave, K. (Editors), Methods in Enzymology, Vol. XXII
(Part B), Academic Press, 195-206, (1968)