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8.1 Testmethoden 115
Temperaturdifferenz ΔTm zwischen Tm der DNA in Gegenwart einer DNA-bindenden
Substanz und Tm der reinen DNA können Rückschlüsse auf die Bindungsstärke zwi-
schen DNA und Substanz gezogen werden. 142 In der Regel zeigen DNA-Interkalato-
ren keine Sequenzselektivität bei der Einlagerung zwischen den Basenpaaren, so
143, 144
daß der ΔTm-Wert für GC- oder AT-reiche Sequenzen nahezu konstant bleibt.
Demgegenüber zeigen DNA-Rinnenbinder bei ihrer Stabilisierung der DNA-Doppel-
helix oft eine Sequenzselektivität, die sich an den unterschiedlichen ΔTm-Werten bei
GC- oder AT-reichen Sequenzen zeigt 145 . Ebenso muß angemerkt werden, daß ein
Abfall der Denaturierungstemperatur eintreten kann, wenn, wie im Falle des Cispla-
tins, die Substanz - im Vergleich zur doppelsträngigen - stärker an einzelsträngige
DNA bindet. In dem genannten Beispiel bildet das Platin Komplexe zwischen den
Basen desselben Strangs aus. 146
Da die Aufheizung der Probe über ein angeschlossenes Wasserbad erfolgte, mußten
die Tm-Bestimmungen mit dem synthetischen Polynukleotid Poly[dAdT]*Poly[dAdT]
als DNA durchgeführt werden, das eine Schmelztemperatur von 46°C besitzt. Hier-
durch war es möglich, auch Substanzen mit hohen ΔTm-Werten (>40°C) zu vermes-
sen. Bei einem GC-reichen Polynukleotid ist der Temperaturbereich des Wasserbads
schnell überschritten, so daß die Denaturierungstemperaturen von Substanzen mit
einer hohen DNA-Bindungsaffinität nicht bestimmt werden können.
Bei der verwendeten Testapparatur handelt es sich um eine Eigenentwicklung b) , die
mit literaturbekannten Referenzverbindungen validiert wurde. Die in Tabelle 8-2 an-
gegebenen ΔTm-Werte zeigten mit Ausnahme von Ethidiumbromid eine gute Über-
einstimmung mit den Literaturwerten. Referenz- und Testsubstanzen wurden im Ver-
hältnis [DNA]:[Ligand] = 1:1 in einem Phosphatpuffer vermessen. 147
142 Wilson, W. D.; Tanious, F. A.; Fernandez-Saiz, M.; Rigl, C. T.; Fox, K. R. (Editor); Drug-DNA Interaction
Protocols; Humana Press, Totowa, USA, (1997)
143 Wilson, W. D.; Blackburn, M. (Editor); Gait, M. (Editor); Nucleic Acids in Chemistry and Biology:
Reversible Interactions of Small Molecules with Nucleic Acids; Oxford IRL, Oxford, UK, 295-336;
(1990)
144 Wilson, W. D.; Ratmeyer, L.; Zhao, M.; Strekowski, L.; Boykin, D.; Biochemistry, 32, 4098-4104,
(1993)
145 Zimmer, C.; Wahnert, U.; Prog. Biophys. Mol. Biol., 47, 31-112, (1986)
146 Brabec, V.; Reedijk, J.; Leng, M.; Biochemistry, 31, 12397-12402, (1992)
b) Perlick, C.; Schneider, G.
147 Bailly, C.; Qu, X.; Anizon, F.; Prudhomme, M.; Riou, J. F.; Chaires, J. B.; Molec. Pharm., 55, 377-
385, (1999)