La Diagnosi di Laboratorio delle Malattie da Protozoi - tutte mappe

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1. Carbolfuscina Si pongono poche gocce di sospensione di copros su un vetrino portaoggetti e si mescolano con una goccia di carbolfucsina; si lascia asciugare e si osserva al microscopio con obiettivo 20x - 40x. Le oocisti tondeggianti o ovoidali con inclusioni puntiformi o a virgola, appariranno in negativo, perchè non assumono il colore, e spiccano sullo fondo colorato in rosso. 110 Oocisti di Cryptosporidium spp. 400x (Col. carbolfucsina) Si deve, comunque, considerare che la carbolfucsina non è un colorante molto specifico ed inoltre che il preparato si altera con il passare del tempo: osservazioni microscopiche del preparato, oltre i 15-20 minuti dalla preparazione, risulterebbe falsamente negativo perchè il colorante col tempo penetra nella oocisti. È indispensabile, pertanto, utilizzare una colorazione permanente come quella di Ziehl-Neelsen mod. che risulta molto più specifica e facile da interpretare. 2. Ziehl-Neelsen modificato La colorazione si fonda sul principio della acido-alcool resistenza; la parete delle oocisti dei coccidi è molto resistente al trattamento sia con alcool che con acido, pertanto una volta assunto il colorante primario, la carbolfucsina, sono resistenti al trattamento con solventi organici forti come la miscela acido-alcool. Per questa ragione i microrganismi che presentano tale caratteristica, come tutti i coccidi, vengono chiamati acido-alcool resistenti. La colorazione per l’acido-resistenza modificata da Kinyoun viene chiamata “metodo a freddo” in quanto impiega un detergente tensioattivo che aggiunto alla carbolfucsina facilita la colorazione primaria, senza dover ricorrere al riscaldamento del preparato.
Esecuzione: • Si preparano strisci del campione su vetrino portaoggetto. • Il preparato viene lasciato asciugare per 24 h. • Fissazione in metanolo per 10’. • Deporre sul preparato la carbolfucsina per 15’-20’. • Lavare con acqua di fonte, quindi asciugare su carta assorbente. • Aggiungere il decolorante (soluzione di acido acetico in alcool etilico) per 15”-30”. • Lavare con acqua di fonte e lasciar asciugare. • Deporre il colorante di contrasto (blu di metilene o verde di malachite) per 2’-5’. • Lavare con acqua di fonte e lasciar asciugare Si osserva al microscopio ottico con obiettivo 10, 20 e 40x Criptosporidium spp. (Col. Ziehl-Neelsen mod.) colorazione di contrasto blu di metilene 100x e 400x Criptosporidium spp. (Col. Ziehl-Neelsen mod.) colorazione di contrasto verde di malachite 200x e 400x 111
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