La Diagnosi di Laboratorio delle Malattie da Protozoi - tutte mappe

1) Sequenza da amplificare.
2) NTP (nucleosidi trifosfati, come ATP, CTP, GTP, TTP).
3) Primer (Sequenze complementari agli estremi della sequenza da amplificare).
4) Taq polimerasi (una DNA polimerasi estratta da un batterio termofilo, in grado di
non denaturarsi ad alte temperature).
5) Soluzione Buffer (i tamponi necessari per la reazione di elongazione).
Un tipico ciclo di PCR:
La PCR avviene in una serie di cicli composti da tre fasi:
1. Denaturazione al calore di uno stampo di DNA che deve essere copiato (94 - 99 °C)
2. Appaiamento (annealing) di coppie di primer (30 - 65 °C)
3. Estensione da parte della Taq polimerasi a partire dai primer appaiati (65 - 72 °C)
I “prodotti lunghi” originati in questo modo fungeranno da stampi per l’uno o l’altro
degli oligonucleotidi durante i cicli succcessivi, e l’estensione di questi oligonucleotidi
dalla polimerasi produrrà molecole di una lunghezza definita, corrispondente a
quella della sequenza di interesse.
Queste molecole fungeranno anch’esse come stampi per l’uno o per l’altro oligonucleotide
producendo altre molecole di grandezza definita. In questo modo si svilupperà
una reazione a catena che porterà all’accumulo di uno specifico DNA in maniera
esponenziale rispetto al numero di cicli di reazione, cioè la loro quantità sarà,
linearmente proporzionale, al numero di cicli effettuati.
La PCR è una tecnica ancora in sperimentazione, quindi non viene utilizzata dai laboratori
per le identificazioni routinarie: il principale problema della tecnica di PCR è
la contaminazione dei prodotti di amplificazioni che può causare la presenza di falsi
positivi a partire da sequenze aspecifiche.
Pertanto il laboratorio per effettuare analisi in PCR deve essere attrezzato con stanze
separate dalle altre operazioni, vetreria dedicata e massima sterilità dei materiali.
Infine gli alti costi dei reattivi rendono questa nuova tecnica ancore di difficile impiego.
In Parassitologia viene impiegata, da laboratori di referenza altamente specializzati,
per identificare plasmodi malarici e Babesia nei campioni ematici, Leishmania in
aspirato midollare e sangue, Toxoplasma in liquor e/o broncoaspirato e sangue,
Pneumocystis jirovecii in espettorato, liquido di lavaggio broncoalveolare o broncoaspirato.
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