La Diagnosi di Laboratorio delle Malattie da Protozoi - tutte mappe

5) Tecniche di biologia molecolare dirette: PCR
Per diagnostica molecolare in Parassitologia si intende solitamente la possibilità di
identificare un organismo in base ad una o più sequenze geniche specifiche.
La diagnostica molecolare si rivela spesso, ma non sempre, più sensibile e/o più specifica
dei metodi tradizionali e si ricorre sempre più ad essa quando il microrganismo
è difficilmente od affatto coltivabile, quando cresce molto lentamente in vitro
(Leishmania spp), quando la sua manipolazione può essere troppo pericolosa per
l’operatore e/o per la comunità (come ad esempio per antrace e, più in generale, per
tutti gli altri agenti di classe A potenzialmente implicati in attacchi bioterroristici,
con particolare riguardo ai virus delle febbri emorragiche), quando infine il costo di
una diagnosi tradizionale è più elevato di quello di una diagnosi molecolare.
Presenta inoltre il vantaggio di poter in particolari casi essere effettuata direttamente
sul campione, di non avere la necessità di attendere che il microrganismo
cresca e neppure che il microrganismo sia vivo al momento del processamento del
campione.
Molte delle tecniche correntemente usate in un laboratorio di diagnostica si basano
sull’amplificazione mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) degli acidi nucleici,
sia di specifici frammenti di DNA che di RNA dopo trascrizione in cDNA attraverso
l’uso di una trascrittasi inversa.(RT-PCR).
Una volta amplificati questi frammenti possono essere analizzati in vari modi:
dimensione dei frammenti, analisi delle sequenze, riamplificazione con una seconda
coppia di primer o ibridizzazione con sonde marcate. L’analisi può essere sia qualitativa
che quantitativa, attraverso i vari formati delle tecniche di Real-time PCR. Un
metodo molto usato per l’identificazione è l’analisi della sequenza di particolari parti
del genoma (per esempio, 16S o 23S rRNA).
In generale, i metodi di diagnostica molecolare a fronte di innegabili vantaggi, presentano
alcuni punti critici: richiedono un diverso grado di competenze tecniche da
parte degli operatori, sono più costosi per quanto riguarda le apparecchiature e, in
generale, l’interpretazione dei risultati richiede un più elevato livello di competenze.
E ancora: i metodi basati sul DNA non distinguono fra microrganismi vivi e morti; i
metodi basati sull’amplificazione dell’RNA (RT-PCR) possono identificare i microrganismi
vivi (ma non le spore) e sono molto più complessi da utilizzare dei metodi
tradizionali. Inoltre questi metodi se usati direttamente sul campione, non permettono
che il microorganismo possa essere ulteriormente processato. Per altri metodi
come il microarray, la limitazione è data dalla necessità di costruire un database il più
ampio e completo possibile perché possa essere utilizzato fruttuosamente.
Tuttavia con l’introduzione di queste nuove metodiche, la diagnostica ha avuto cambiamenti
in termini di sensibilità e rapidità impensabili solo pochi anni fa.
La PCR è una tecnica che prevede l’amplificazione di una sequenza di DNA di cui
si conoscono gli estremi: in particolare per realizzarla si ha bisogno di:
31