La Diagnosi di Laboratorio delle Malattie da Protozoi - tutte mappe

3. Test molecolari
Molte delle tecniche correntemente usate in un laboratorio di diagnostica si basano
sull’amplificazione mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) degli acidi nucleici,
sia di specifici frammenti di DNA che di RNA dopo trascrizione in cDNA attraverso
l’uso di una trascrittasi inversa.(RT-PCR).
Una volta amplificati questi frammenti possono essere analizzati in vari modi: dimensione
dei frammenti, analisi delle sequenze, riamplificazione con una seconda coppia
di primer o ibridizzazione con sonde marcate. L’analisi può essere sia qualitativa che
quantitativa, attraverso i vari formati delle tecniche di Real-time PCR.
Toxoplasma gondii può essere ricercato con la tecnica di Real-time PCR attraverso
l’utilizzo di due sonde specifiche di ibridazione, le sonde sono due diversi oligonucleotidi
che si appaiono ad una sequenza del frammento amplificato durante la fase
di anneling del ciclo di PCR. Una sonda è marcata all’estremità 5’ con un fluorescinato,
mentre l’estremità 3’ è fosforillata, l’altra sonda è marcata all’estremità 3’ con
fluorescina.
Solo dopo l’appaiamento allo stampo di DNA che ricerchiamo le due sonde arrivano
in stretta connessione e ciò si traduce in una marcata produzione di fluorescenza,
misurando l’emissione di fluorescenza, con una apparecchiatura dedicata, si ottiene
il risultato dell’esame.
Il DNA genomico di Toxoplasma gondii può essere purificato da diversi campioni
biologici:
• sangue periferico,
• BAL (liquido di lavaggio broncoalveolare),
• sangue del cordone ombelicale,
• liquor,
• villi corionici,
• fluido amniotico.
Il campione biologico viene trattato con 200µl di acqua distillata ultrapura e 50 µl di
tampone fosfato pH 7.2; accanto al campione da analizzare viene sempre testato un
controllo positivo e un controllo negativo per saggiare la riuscita della reazione.
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