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Transkriptionsregulator PhoR in Escherichia coli überproduziert und gereinigt. Mit den
isolierten Proteinen konnte die Autokinase-Aktivität von PhoS sowie der Transfer der
Phosphorylgruppe von PhoS auf PhoR nachgewiesen werden. Weiterhin konnte bei
den Untersuchungen zur Funktion des Repressors AcnR aus C. glutamicum gezeigt
werden, dass das vermutlich einzige Zielgen dieses Regulators das Aconitase-Gen
darstellt. Das gereinigte Repressor-Protein bildet wie viele andere TetR-Typ-
Regulatoren ein Dimer und es konnten Hinweise erhalten werden, daß die
carboxyterminale Domäne des Proteins für die Dimerisierung verantwortlich ist.
o Die Stamm- und Prozessentwicklung des in den Vorjahren konstruierten Ganzzell-
Biotransformationssystems für die D-Mannitol Bildung aus D-Fructose wurde durch
den Einsatz von extrazellulärer Glukose-Isomerasen und der Koexpression der
Glukose-Isomerase in E. coli fortgesetzt. Hierdurch war eine Umstellung des
Substrats von D-Fruktose auf die kostengünstigere D-Glukose möglich. Ferner wurde
zur Entwicklung eines Stammes für die Herstellung von Vitamin C ein rekombinanter
Gluconobacter oxydans Stamm konstruiert, der alle für die Umsetzung von Sorbit zu
2-Keto-L-gulonsäure essentiellen Gene funktionell exprimiert. Dieser Stamm ist in der
Lage, geringe Mengen 2-Keto-L-gulonsäure aus Sorbit zu bilden. Zurzeit wird
versucht, die Bildung der 2-Keto-L-gulonsäure zu verbessern.
o Einige pathogene Gram-positive Bakterien (wie z.B. Staphylococcus aureus oder
Mycobacterium tuberculosis) besitzen neben dem klassischen Sec-(Sec1)-Weg noch
ein alternatives Sec-System (Sec2), das für die Sekretion von einigen wenigen
Proteinen verantwortlich ist. Diese oft sehr grossen Proteine sind für die Virulenz der
betreffenden Mikroorganismen von entscheidender Bedeutung. Bislang ist noch völlig
unklar, welche Eigenschaften der Sec2-Exportproteine für die spezifische
Einschleusung in den Sec2-Weg verantwortlich sind. Wir konnten nun zeigen, dass es
im Gegensatz zur Situation beim klassischen Sec1-Weg neben dem Signalpeptid
noch weitere, im reifen Teil der Sec2-Exportproteine gelegene Determinanten geben
muss, die für die Aufrechterhaltung der Exportwegspezifität verantwortlich sind.
Wesentliche Ergebnisse IBT-2
o Die intrazellulären Metabolitdaten aus Fermentationen mit L-Valin
Aminosäureproduzenten wurden mit LC-MS/MS gemessen und mit statistischen
Verfahren analysiert. Die Ausschleusung (Export) des Produkts L-Valin aus der Zelle
wurde als limitierender Schritt für die L-Valin Produktion identifiziert. Weitere Analysen
legen den Schluss nahe, dass im Stoffwechselnetzwerk des Organismus C.
glutamicum ein bisher nicht bekannter alternativer Zugang zu dem Metaboliten
Ketopanthoat (Panthotensäure Vorläufer) existiert.
o Für die fermentativen Cyclitol-Produkte (2,3-CHD und 3,4-CHD) konnten Verfahren
zur Reaktivextraktion mit einem anionenselektiven Extraktionssystem entwickelt und
in den Fermentationsprozeß integriert werden. Das Aminocyclitol 2,3-CHA kann über
ein kationenselektives Extraktionssystem erfolgreich aufgearbeitet werden. Damit
stehen Reaktivextraktionsverfahren für die Cyclitole als auch die Aminocyclitole zu
Verfügung.
o Für die Synthese von Statinen (Cholesterinsenker) werden 3,5-
Dihydroxyhexansäurederivate benötigt. In Zusammenarbeit mit dem Institut für
Enzymtechnologie der Universität Düsseldorf (Prof. Hummel) wurde eine neue
Alkoholdehydrogenase identifiziert und erfolgreich zur hochenantioselektiven
Reduktion der Vorläuferverbindungen (3,5-Dioxoester) eingesetzt.
o Für die Synthese reduzierter Nicotinamidcofaktoren wurde ein thermischer
Abschnittsreaktor mit integrierter Wasserstoff-Volumenbegasung entwickelt.
Hierdurch lässt sich die Raum-Zeitausbeute für das Verfahren auf 82 (g/(L x d))
steigern. Es wurden Strategien für eine Produktaufarbeitung entwickelt.
o Für die Gentherapie ist die Verfügbarkeit von Plasmid DNA (pDNA) im präparativen
Maßstab von zentraler Bedeutung. Es gelang, pDNA und RNA durch wässrige
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