Dokument 2.pdf - OPUS-Datenbank - Universität Hohenheim
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5.2 Untersuchungen zum Butanol-Metabolismus<br />
Butanolkonzentrationen der mit Butanol behandelten Proben betrugen 0,5 g/l bzw.<br />
3 g/l. Nach einer Stunde (OD 600 von 0,5 - 0,8) wurden die Zellen wie in Abschnitt 4.2.3<br />
beschrieben geerntet, gewaschen und anschließend bei -80 ◦ Cgelagert. Bei der Analyse<br />
des Proteoms wurden Vergleiche zwischen „Glucose und 0,5 g/l Butanol“, „Glucose und<br />
3 g/l Butanol“ sowie „0,5 g/l und 3 g/l Butanol“ durchgeführt. Dabei wurde Butanol als<br />
Puls zu den bereits auf Glucose kultivierten Proben hinzugegeben.<br />
5.2.1.1 Analyse der zytosolischen Fraktion durch 2D-DIGE<br />
Der Vergleich zwischen der Kontrolle (Glucose) und den beiden behandelten Proben<br />
(0,5 g/l und 3 g/l Butanol) erfolgte in zwei unabhängigen 2D-DIGE-Experimenten.<br />
Für jeden der beiden Vergleiche kam dabei ein eigener interner Standard, gemischt aus<br />
den drei biologischen Replikaten der Kontrolle und den drei biologischen Replikaten<br />
der entsprechend behandelten Probe, zum Einsatz. Aufgrund der Verwendung zweier<br />
unterschiedlicher interner Standards musste der Vergleich zwischen den mit 0,5 g/l und<br />
3 g/l Butanol behandelten Proben ohne einen internen Standard durchgeführt werden.<br />
Dies hatte jedoch lediglich einen Einfluss auf die verwendete Normalisierungsmethode<br />
in der Analysesoftware Progenesis SameSpots.<br />
Tabelle 5.5: Übersicht über die im Rahmen der Analyse des Butanol-Metabolismus durchgeführten<br />
2D-DIGE Experimente.<br />
Stamm pH Behandlung Spots a Protein<br />
Reg.<br />
Analysierte<br />
Ident.<br />
Spots b<br />
Spots c<br />
Spots d<br />
Spots<br />
KT2440 4-7 Glucose vs. 0,5 g/l<br />
BuOH<br />
KT2440 4-7 Glucose vs. 3 g/l<br />
BuOH<br />
KT2440 4-7 0,5 g/l vs. 3 g/l<br />
BuOH<br />
1877 1492 48 22 22<br />
3680 1677 137 37 37<br />
2603 1740 79 20 18<br />
a Anzahl der insgesamt detektierten Spots.<br />
b Anzahl der Spots, welche in die Auswertung einbezogen wurden (Spikes und Artefakte wurden<br />
zuvor entfernt).<br />
c Anzahl der Spots, welche nach statistischen Kriterien reguliert waren.<br />
d Anzahl der Spots, welche nach manueller Validierung ausgestochen und massenspektrometrisch<br />
analysiert wurden.<br />
Wie bei allen in dieser Arbeit beschriebenen 2D-DIGE-Experimenten wurden als Kriterien<br />
für die Regulation eines „Spots“ eine Änderung der Fluoreszenzintensität (bzw.<br />
des Spotvolumens) um einen Faktor von 1,8 (bzw. 0,6) und ein p-Wert < 0,05 vor-<br />
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