Dokument 2.pdf - OPUS-Datenbank - Universität Hohenheim

5 Ergebnisse
5.1 Untersuchungen zum Abbau von Ethylenglycol
Die Synthese von Glyoxylsäure (GXS) aus Ethylenglycol (EG) in Pseudomonas putida
KT2440 stellt das Fernziel dieses Teilprojektes dar. Eine Identifizierung der am Abbau
von Ethylenglycol aber auch Glyoxylsäure beteiligten Enzyme sowie das Verständnis
der zugrundeliegenden Regulationsmechanismen, war hierzu ein entscheidender Schritt.
Neben Pseudomonas putida KT2440 wurde auch der Stamm Pseudomonas putida JM37
analysiert, welcher bereits von Li et al. (2010) auf den Metabolismus von Glyoxylsäure,
jedoch nicht auf den Abbau von Ethylenglycol untersucht wurde. Während der
Fokus im Rahmen dieser Arbeit auf Pseudomonas putida KT2440 lag, diente Pseudomonas
putida JM37 lediglich als Referenz. Zusätzlich wurden auch zwei Mutanten von
Pseudomonas putida KT2440 analysiert, welche auf Basis der im Wildtyp erhobenen
Daten von der Arbeitsgruppe Altenbuchner (Universität Stuttgart, Institut für Industrielle
Genetik) erzeugt wurden. Diese Mutanten wurden mit GN187 (∆upp, ∆prpB,
∆gcl, ∆glcB) und GN259 (∆upp, ∆prpB, ∆gcl, ∆glcB, ∆aceA) bezeichnet. Um den
unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften der Proteine und den Limitierungen
der einzelnen Analysemethoden gerecht zu werden, wurden sämtliche Proben in
eine zytosolische und eine Membranfraktion aufgeteilt. Die differenzielle Quantifizierung
der zytosolischen Fraktion erfolgte mittels 2D-DIGE, die der Membranfraktion
über einen labelfreien massenspektrometrischen Ansatz. Alle Experimente wurden mit
drei biologischen Replikaten durchgeführt. Der Ablauf der Probenvorbereitung und der
quantitativen Analyse ist in Abbildung 5.1 dargestellt.
Die Kultivierung der Bakterienstämme erfolgte in Kooperation mit der Arbeitsgruppe
Hauer (Universität Stuttgart, Institut für Technische Biochemie) und ist in Kapitel
4 im Detail beschrieben. Die Anzucht der Bakterien wurde in M12-BASF Medium,
welches 10 mM Glucose als Kohlenstoffquelle enthielt, durchgeführt. Die Zugabe von
Ethylenglycol bzw. Glyoxylsäure erfolgte nach zwölfstündiger Kultivierung als Puls,
die Ernte der Zellen nach weiteren 5 h. Es ist zu vermuten, dass sich die Zellen zum
Zeitpunkt der Zugabe der Testsubstanzen bereits in der stationären Phase befanden.
Die Ernte der Zellen, der Aufschluss sowie die Proteinbestimmung sind in Kapitel 4
beschrieben.
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