Dokument 2.pdf - OPUS-Datenbank - Universität Hohenheim

5.1 Untersuchungen zum Abbau von Ethylenglycol
5.1.1 Analyse der zytosolischen Fraktionen durch 2D-DIGE
5.1.1.1 Der Metabolismus von EG und GXS in Pseudomonas putida KT2440
Die Gelbilder sowie die Listen der darin regulierten Proteine der im Folgenden besprochenen
Versuche sind im Anhang, sortiert nach Kapitelüberschriften zu finden.
Optimierung der 2D-Gelelektrophorese
Um den optimalen pH-Bereich für die isoelektrische Fokussierung der Pseudomonas
putida-Proben zu ermitteln, wurde die Trennleistung zweier unterschiedlicher IPG-
Streifen (pH 4-7 und pH 3-11) mit identischen Proteinextrakten getestet. Hierzu wurden
Ethylenglycol-induzierte Proben von P. putida KT2440 und entsprechende auf Glucose
kultivierte Kontrollen eingesetzt. Die Markierung der induzierten Proben erfolgte mit
dem Fluoreszenzfarbstoff Cy3, die der nicht induzierten Proben mit Cy5. Der interne
Standard wurde aus allen sechs zu analysierenden Proben gemischt und mit Cy2
markiert. Insgesamt konnten bei Verwendung des IPG-Streifens (pH 4-7) 1747 Spots
detektiert werden. Nach dem Entfernen von Farbstoffartefakten (Spikes) und Verunreinigungen,
welche von der verwendeten Analysesoftware fälschlicherweise als Spots
annotiert wurden, verblieben 885 Spots. Hiervon wiesen 91 eine signifikante Regulation
nach den zu Grunde gelegten statistischen Kriterien (Regulationsfaktor > 1,8; p-Wert
< 0,05) auf.
Da über die Filterfunktion der Software nicht alle Artefakte (Farbstoffe, Staub, etc.)
entfernet werden konnten und auch schwache Spots welche wenig Protein enthielten
(schlechte massenspektrometrische Identifizierbarkeit) von der weiteren Analyse ausgeschlossen
werden sollten, wurden alle regulierten Spots zusätzlich manuell überprüft.
Dies führte in einigen Fällen zu einer deutlichen Reduktion der zu analysierenden Spots.
Nach erfolgter manueller Validierung wurden 21 regulierte Proteinspots aus dem Gel
ausgestochen und mit Trypsin verdaut. Bei der nachfolgenden massenspektrometrischen
Analyse konnten in allen 21 regulierten Spots ein oder mehrere Proteine identifiziert
werden.
Die Verwendung des IPG-Streifens (pH 3-11) erlaubte die Detektion von insgesamt 1624
Spots (keine Artefakte), wovon 79 nach den o.g. statistischen Kriterien reguliert waren.
Nach manueller Validierung wurden 23 Spots mit Trypsin verdaut und massenspektrometrisch
analysiert. Dabei konnten in 21 Spots ein oder mehrere Proteine identifiziert
werden. In den beiden übrigen Spots wurden keine Proteine identifiziert. 13 der in
diesem Experiment reguliert gefundenen Spots lagen in einem pH-Bereich von pH 4-7,
10 in einem pH-Bereich jenseits von pH 7. Da sechs der regulierten Spots, welche in
einem pH-Bereich größer als 7 lagen, lediglich Isoformen eines Enzyms (PP_2679) enthielten
und ein Spot nicht identifiziert werden konnte, konnten aufgrund des breiteren
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