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6 Diskussion
senspektrometrischer Quantifizierung angewandt. Dabei wurde der zytosolische Anteil
der Proben über 2D-DIGE, die Membranfraktion über labelfreie massenspektrometrische
Quantifizierung analysiert. Durch die gezielte Hydrolyse der Proteine zu Peptiden
konnten bei den LC-ESI-MS/MS-basierten Quantifizierungsmethoden die Nachteile,
welche die zweidimensionale Gelelektrophorese aufgrund der geringen Löslichkeit stark
hydrophober Membranproteine aufweist, umgangen werden. Eine Analyse des „Gesamtproteoms“
über GeLCMSMS erfolgte zusätzlich in den Versuchen zum Butanol- (Bioreaktor)
und Vanillin-Metabolismus. Der grundlegende Versuchsaufbau der in dieser
Arbeit durchgeführten Experimente, wurde in Abbildung 5.13 am Beispiel des Butanol-
Teilprojekts schematisch dargestellt, ist aber mit dem der Vanillin-Experimente identisch.
Anhand des Vanillin-Teilprojekts soll ein Vergleich der eingesetzten Methoden im Hinblick
auf die Zahl der identifizierten bzw. quantifizierten Proteine sowie deren Lokalisation
in der Zelle erfolgen. Hierbei sind die Besonderheiten der gelbasierten bzw. LC-
ESI-MS/MS-basierten Analysemethoden zu berücksichtigen. Da in einem 2D-DIGE-
Experiment nur diejenigen Spots identifiziert wurden, welche eine Regulation aufwiesen,
entsprach die Zahl der quantifizierten Proteine bei dieser Methode immer der Anzahl
der identifizierten Proteine. Zudem befanden sich in einem „Spot“ meist mehrere Proteine,
da Proteine mit gleichem oder sehr ähnlichem pI und Molekulargewicht mittels
der verwendeten 2D-DIGE-Methode (pH 4-7) nicht ausreichend getrennt werden können.
Um das regulierte Protein in einem Spot zu bestimmen, wurde das abundanteste
Protein eines Spots (gemessen an der Anzahl der identifizierten Peptide) als reguliert
betrachtet. Aufgrund posttranslationaler Modifikationen oder Proteinabbau kann ein
Protein oder eine Isoform desselben zudem in mehr als einem Spot vorhanden sein.
Die Möglichkeit diese Proteine zu trennen, stellt einen klaren Vorteil der 2D-DIGE-
Methode gegenüber peptidbasierten Methoden (labelfreie Quantifizierung), dar. Der
Rückschluss von der Regulation einzelner Peptide auf die Regulation eines Proteins
ist dann problemtisch, wenn nur eine von mehreren Isoformen, welche einen Großteil
identischer Peptide enthalten, reguliert ist. Ein Vorteil der peptidbasierten Quantifizierung
liegt hingegen in der Identifizierung einer großen Anzahl von Proteinen (auch
nicht-regulierter) mit vertretbarem zeitlichen Aufwand.
Um 2D-DIGE und labelfreie Quantifizierung vergleichen zu können, wurden für die
Darstellung in Abbildung 6.3 folgende Annahmen getroffen: Die Diagramme zur Verteilung
der Proteine auf die einzelnen Kompartimente (Zytoplasma, Membran, etc.)
beziehen sich sowohl für die 2D-DIGE-Analyse als auch für die beiden labelfreien Ansätze
ausschließlich auf den Anteil der regulierten Proteine. Waren in einem Spot der
2D-DIGE-Analyse mehrere Proteine enthalten, wurde, wo immer möglich, nur das abundanteste
Protein dieses Spots als reguliert betrachtet. Wurden mehrere Proteine in
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