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3 Einleitung
schwierig. Substanzen, welche die Solubilisierung von Proteinen verbessern (Detergenzien,
Salze) sind wiederum nicht mit massenspektrometrischen Analysen kompatibel
oder würden deren Sensitivität stark reduzieren. Daher werden in Ansätzen, welche die
Identifizierung von Proteinen in komplexen Proben zum Ziel haben, durch eine spezifische
Protease erzeugte Peptide anstelle ganzer Proteine analysiert (sog. „bottom-up“
Ansatz).
Als Protease wird aufgrund seiner Spezifität, Stabilität und Aktivität (geringe Anzahl
an Fehlschnitten) häufig Trypsin verwendet. Trypsin, welches C-terminal von Lysin und
Arginin schneidet, erzeugt in der Regel Peptide in einer für die Massenspektrometrie
geeigneten Größe, welche neben der N-terminalen Aminogruppe an den Seitenketten
von Lysin und Arginin noch eine zweite Aminogruppe tragen. Dies ist im Hinblick auf
Ionisation und Fragmentierung der Peptide ideal (Lottspeich, 2012). Neben der Bestimmung
des m/z-Verhältnisses eines Peptides sind für eine präzise Identifizierung auch
Informationen über die Aminosäuresequenz des Peptides von großem Vorteil. Diese
Information kann im Rahmen einer massenspektrometrischen Analyse durch eine Fragmentierung
von Peptiden mittels verschiedener Verfahren (CID, ETD, HCD) erhalten
werden und wird als MS/MS oder MS 2 -Analyse bezeichnet.
Die Analyse von Peptiden anstelle ganzer Proteine bringt jedoch auch eine weitere
Steigerung der Komplexität der Probe mit sich. Besonders bei im Vorfeld nicht fraktionierten
Proben, können auch moderne Massenspektrometer nicht alle in einer Probe
vorhandenen Peptide erfassen. Um die Komplexität der Probe zu reduzieren, wird der
eigentlichen massenspektrometrischen Analyse ein chromatographisches Trennverfahren
vorangestellt. Da sich die Anforderungen im Hinblick auf die Trennung je nach
Fragestellung unterscheiden, wurden auch in diesem Bereich eine Vielzahl von Methoden
und Geräten entwickelt. Einen Überblick gibt der Review von Sandra et al. (2008).
Die gängigste Methode zur Trennung von Peptiden ist die RP-HPLC (Reversed-Phase
High Performance Liquid Chromatography) bei der die einzelnen Peptide aufgrund
ihrer Hydrophobizität voneinander getrennt werden. Nach der initialen Bindung der
Peptide an ein hydrophobes Säulenmaterial erfolgt deren sukzessive Elution. Durch
die Erhöhung des Anteils an organischem Lösungsmittel in der mobilen Phase werden
die Peptide, nach steigender Hydrophobizität geordnet, von der Säule gelöst. Da für
die Elution flüchtige Lösungsmittel verwendet werden, die keine für das MS störenden
Substanzen wie z.B. Salze enthalten, kann die Reversed-Phase Chromatographie
direkt („online“) an ein mit einer entsprechenden Ionen-Quelle ausgestattetes Massenspektrometer
gekoppelt werden. Wie Abbildung 3.7 zeigt, erhält die Analyse durch die
Online-Kopplung zusätzlich zum ermittelten m/z-Verhältnis eine zeitliche Dimension
(Contour-Plot, X-Achse). Der Contour-Plot ist eine Darstellung, welche alle Informationen
eines LC-MS-Experiments (nicht MS/MS) in einer Grafik zusammenfasst. Dabei
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