Dokument 2.pdf - OPUS-Datenbank - Universität Hohenheim

4.4 Gelelektrophorese
thcare) überführt. Die Probe wurden dann über ein „Cup“ an der Anode auf den Streifen
aufgebracht und die Fokussierung mit den in Tabelle 4.9 angegebenen Parametern
gestartet. Die Proteine gelangten somit erst während der ersten Schritte der Fokussierung
in den IPG-Streifen. Auch hier wurde die maximale Stromstärke auf 75 µA pro
IPG-Streifen beschränkt.
Tabelle 4.9: Parameter der isoelektrischen Fokussierung für Rehydration- und Cup-Loading.
Unter dem Punkt „Programm“ ist angegeben, ob es sich um eine kontinuierliche Anhebung
der Spannung (Gradient) oder eine schrittweise Anhebung handelte.
Programm Spannung (V) Zeit (h)
1. Schritt 150 2
2. Schritt 300 2
3. Gradient 1000 8
4. Gradient 8000 3
5. Schritt 8000 7
6. Schritt 50 8
Im Anschluss an die isoelektrische Fokussierung wurden die Streifen für die folgende
SDS-PAGE (2. Dimension) vorbereitet. In einem ersten Schritt wurden vorhandene
Cysteine reduziert. Hierzu wurden die fokussierten Streifen für 15 min in 15 ml 65 mM
DTT (Dithiothreitol) in Äquilibrierungspuffer inkubiert und möglicherweise vorhandene
Disulfidbrücken reduziert. Die freien Thiolgruppen der Cysteine wurden im Anschluss
durch 15 ml 135 mM IAA (Iodacetamid) in Äquilibrierungspuffer für 15 min alkyliert
und somit die erneute Ausbildung von Disulfidbrücken unterbunden. Zudem wurde
durch den Austausch des Puffers die Harnstoffkonzentration in den IPG-Streifen gesenkt
und das für die zweite Dimension benötigte SDS zugeführt. Im Anschluss wurden die
Streifen mit H 2 O gespült.
4.4.3.4 Die 2. Dimension (SDS-PAGE)
Für die zweite Dimension wurden die äquilibrierten IPG-Streifen auf die in Abschnitt
4.4.3.1 gegossenen Gele aufgebracht und mit 0,5% (w/v) Agarose, 0,01% (w/v) Bromphenolblau
fixiert. Dabei wurde auf einen luftblasenfreien Kontakt zwischen Gel und
IPG-Streifen geachtet. Die elektrophoretische Trennung erfolgte in einer „Ettan DALTsix
Electrophoresis Unit TM “ (GE Healthcare). Um auch bei den hier verwendeten langen
Laufzeiten eine quantitative Beladung der Proteine mit SDS zu gewährleisten, kamen
in den beiden Pufferkammern zwei unterschiedliche Pufferkonzentrationen zum Einsatz.
Der 2D-Gel-Laufpuffer der oberen Pufferkammer (Kathode) war zweifach, der
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