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3 Einleitung weiter zu erhöhen, ist die Verwendung einer „scheduled SRM“-Methode. Diese Methode beruht auf der Tatsache, dass ein bestimmtes Peptid in einem definierten Zeitraum von der RP-Säule eluiert und SRM-Übergänge, welche der Detektion dieses Peptides dienen, nur während dieser Zeit zu erwarten sind. Somit ist es möglich, bestimmte SRM-Übergänge nur während eines definierten Zeitfensters und nicht während des gesamten Gradienten zu „scannen“. Dies reduziert die Cycle-Time drastisch und erlaubt durch die Erhöhung der Dwell-Time einen deutlichen Sensitivitätsgewinn (Stahl-Zeng et al., 2007). 3.4 Zielsetzung Ziel dieser Arbeit ist es, im Rahmen des Verbundprojekts „Systembiologie in Pseudomonas putida für die industrielle Biokatalyse“, quantitative Veränderungen des Proteoms von Pseudomonas putida KT2440 in Gegenwart verschiedener Substanzen, welche Edukte bzw. Produkte möglicher biotechnologischer Synthesewege darstellen, zu analysieren. Dabei sollen die Auswirkungen der Stoffe Ethylenglycol, Glyoxylsäure, Butanol und Vanillin auf P. putida KT2440 untersucht werden. Eine weitere Analyse zum Metabolismus von Terpenen (Citronellol) soll in P. aeruginosa PAO1 erfolgen, da dieser Organismus, im Gegensatz zu P. putida KT2440, über die nötige genetische Ausstattung verfügt. Ein besonderes Augenmerk liegt bei allen Analysen auf Enzymen, welche für den Abbau der gewünschten Produkte verantwortlich bzw. an der Synthese wirtschaftlich interessanter Zwischen- und Endprodukte beteiligt sind. Zudem sollen Toleranzmechanismen sowie eine mögliche Stressantwort gegenüber den eingesetzten, teilweise toxischen, Substanzen analysiert werden. Im Kontext des Verbundprojekts sollen die erhobenen Proteomdaten durch die Identifizierung von Schlüsselenzymen konkrete Anhaltspunkte für die Entwicklung von Pseudomonas-Mutanten liefern, welche die gewünschten Produkte (Glyoxylsäure, Vanillin, Butanol) synthetisieren und akkumulieren. Diese von den Projektpartnern generierten Mutanten sollen im Anschluss ebenfalls auf quantitative Veränderungen des Proteoms untersucht werden, um Veränderungen im Stoffwechsel aufzuzeigen und mögliche Schritte zur weiteren Optimierung zu identifizieren. Darüber hinaus sollen die erhobenen Proteomdaten zusammen mit Daten aus Transkriptom- und Metabolomanalysen in ein genombasiertes Netzwerkmodell einfließen und zur Simulation des bakteriellen Stoffwechsels herangezogen werden. Für die Quantifizierung zytosolischer Proteine soll die bereits etablierte 2D-DIGE- Methode verwendet werden. Da insbesondere große und hydrophobe Proteine mit dieser Methode nur schwer zu erfassen sind, sollen vor allem für die quantitative Untersuchung 36
3.4 Zielsetzung des Membran- und Gesamtproteoms alternative Methoden der Probenvorbereitung, Fraktionierung und Quantifizierung etabliert werden. Um eine möglichst große Zahl von Proteinen mit überschaubarem zeitlichen und finanziellen Aufwand identifizieren und quantifizieren zu können, sollen hierfür vor allem labelfreie massenspektrometrische Quantifizierungsmethoden zum Einsatz kommen. 37
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5 Ergebnisse Abbildung 5.4: Einteil
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5 Ergebnisse 5.2 Untersuchungen zum
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5 Ergebnisse Locus-Tag Gen Protein
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5 Ergebnisse Tabelle 5.27: Übersic
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6 Diskussion in P. putida JM37 deut
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6 Diskussion al., 1995; Toyama et a
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6 Diskussion stoffquelle abhängig
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6 Diskussion 3 g/l Butanol könnte
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6 Diskussion cken sich dabei nicht
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6 Diskussion setzungsversuche von Y
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6 Diskussion lin zuließ, war die v
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6 Diskussion Publikation Verwendete
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6 Diskussion senspektrometrischer Q
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6 Diskussion Anteil an Proteinen de
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6 Diskussion gezielte und absolute
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6 Diskussion Wie bereits in den üb
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Literatur Alban, Andrew, Stephen Ol
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Literatur Chattopadhyay, Ava, Karin
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Literatur bp inverted repeat sequen
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Literatur Inui, Masayuki, Masako Su
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Literatur Lovric, Josip (2011). Int
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Literatur comparative analysis of t
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Literatur coding three quinoprotein
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Literatur Schmidt, Alexander, Josef
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Literatur Toyama, Hirohide, Zhi-Wei
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Literatur Wood J. M., W. A. und R.
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Abkürzungsverzeichnis CE DC GeLCMS
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Eidesstattliche Versicherung Eidess
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Anhang Alle Tabellen und Abbildunge
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