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3 Einleitung
Wie auch bei der Herstellung von Biobutanol spielen der Marktpreis sowie die Verfügbarkeit
der für die biotechnologische Synthese benötigten Ausgangsstoffe, aber auch die
Resistenz der verwendeten Mikroorganismen, eine entscheidende Rolle. Den am besten
untersuchten Weg zur biotechnologischen Synthese von Vanillin stellt jener von Eugenol
über Ferulasäure zu Vanillin dar, welcher in Pseudomonas putida HR199 untersucht
wurde (Priefert et al., 1999; Overhage et al., 1999b; Overhage et al., 1999a) (Abb.: 3.6
A). Der Ausgangsstoff Eugenol kann kostengünstig aus Nelkenöl hergestellt werden. Die
Ausbeuten dieser Synthese in Pseudomonas putida HR199 blieben jedoch hinter den
von Muheim et al. (1999) in Streptomyces setonii erzielten zurück. Als Ausgangsstoff für
die Umsetzung verwendeten Muheim et al. (1999) allerdings Ferulasäure (log P O/W =
1,4), welche auf Bakterien weit weniger toxisch wirkt als das kostengünstigere Eugenol
(log P O/W = 2,7). Bei hohen Ferulasäurekonzentrationen baute S. setonii im Gegensatz
zu P. putida Vanillin nicht weiter zu Vanillinsäure ab. Worauf diese regulatorische
Besonderheit beruht, ist nicht geklärt.
Neben der Synthese von Vanillin in P. putida HR199 wurde auch dessen Abbau über
Vanillinsäure und Protocatechuat untersucht (Priefert et al., 1997; Overhage et al.,
1999b; Overhage et al., 1999c). Dabei wurden die Enzyme Vanillat-O-Demethylase (VanA/VanB)
und Protocatechuat 3,4-Dioxygenase (PcaG/H) als essentiell für den Vanillinabbau
beschrieben. Das Enzym Vanillin-Dehydrogenase (Vdh) war zwar ebenfalls für
den Abbau entscheidend, seine Funktion konnte aber teilweise durch ein als Coniferyl-
Aldehyd-Dehydrogenase identifiziertes Enzym übernommen werden (Overhage et al.,
1999b). Basierend auf diesen Erkenntnissen postulierten Overhage et al. (1999c) einen
Abbau von Vanillin zu Protocatechuat und eine anschließenden Metabolisierung über
den β-Ketoadipat-Weg zu Succinyl-CoA.
Eine gänzlich andere Strategie wird bei der Herstellung von Vanillin aus Glucose verfolgt.
Dieser Ansatz wurde in einem transgenen E. coli Stamm realisiert (Li et al.,
1998) und basiert auf der Synthese aromatischer Aminosäuren über den so genannten
Shikimatweg (Berg et al., 2003). Dabei wurde die Reduktion von 3-Dehydroshikimat
zu Shikimat durch einen Knockout der Shikimat-Dehydrogenase (AroE) unterbunden
und der Weg zu Protocatechuat (katalysiert durch das in das Genom integrierte
aroZ ) favorisiert. Die Umsetzung zu Vanillinsäure erfolgte mittels einer plasmidkodierten
Catechol-O-Methyltransferase. Im Anschluss wurde Vanillinsäure durch das Enzym
Aryl-Aldehyd Dehydrogenase aus Neurospora crassa in vitro zu Vanillin reduziert. Der
in diesem Projekt verfolgte Ansatz zur Herstellung von Vanillin aus Glucose beruhte
ebenfalls auf dem Aromatenstoffwechsel und verläuft von Glucose über Chorismat zu
Protocatechuat (Abb. 3.6 B). P. putida KT2440 soll hierbei als Basis dienen und durch
heterologe Expression von Genen aus E. coli und anderen Organismen zur Synthese
von Vanillin auf diesem Wege befähigt werden. Das Verständnis des Vanillinabbaus in
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